捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)磷酸丙糖異構(gòu)酶基因克隆、表達(dá)、酶活性分析及重組谷氨酸脫氫酶活性測(cè)定.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)(Haemonchus contortus)屬毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)線(xiàn)蟲(chóng),寄生于反芻動(dòng)物(綿羊、山羊和牛等)第四胃,常因吸血導(dǎo)致宿主貧血和衰弱,引起幼齡動(dòng)物尤其是羔羊的死亡,對(duì)畜牧業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。該病傳統(tǒng)的防治主要采用化學(xué)驅(qū)蟲(chóng)藥和飼養(yǎng)管理相結(jié)合,但隨著近年來(lái)抗藥蟲(chóng)株的出現(xiàn)和蔓延,傳統(tǒng)的化學(xué)防治法已受到了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。研制安全、有效的疫苗是防治該病亟待解決的問(wèn)題。

2、r>　　 磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)是一種糖酵解酶,在機(jī)體內(nèi)參與葡萄糖分解代謝,催化丙糖磷酸異構(gòu)體在二羥丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)換,在糖酵解、糖原異生、脂肪酸生物合成以及磷酸戊糖代謝中都發(fā)揮著重要的作用。本文首次克隆了HcTPI的全長(zhǎng)基因并進(jìn)行了原核表達(dá),并對(duì)重組HcTPI蛋白的酶動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了研究。
　　 1.捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)磷酸丙糖異構(gòu)酶cDNA基因的克隆和序列分析
　　 根據(jù)GenBank中公布的捻

3、轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)磷酸丙糖異構(gòu)酶序列表達(dá)標(biāo)簽EST(登錄號(hào)為CB015183)設(shè)計(jì)基因特異性引物,利用5’-RACE和3’-RACE技術(shù)分別獲得該基因的5’端和3’端未知序列,將這些序列拼接后獲得捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)TPI基因的全長(zhǎng)cDNA序列(986bp),序列分析發(fā)現(xiàn),該基因含有一個(gè)744bp的最大開(kāi)放閱讀框(ORF)、64 bp5’非翻譯區(qū),178bp3’非翻譯區(qū)。根據(jù)此ORF設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,以捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)的總RNA為模板,采用RT-PCR技

4、術(shù),擴(kuò)增出744bp的產(chǎn)物,與推導(dǎo)出的ORF長(zhǎng)度一樣,二者序列同源性為99％。利用DNAstar等軟件,結(jié)合網(wǎng)絡(luò)資源對(duì)其進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基因編碼247個(gè)氨基酸,推測(cè)蛋白的等電點(diǎn)為8.18,分子質(zhì)量為27.47kDa,且含有磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性功能位點(diǎn)序列AYEPVWAIGTG,與許多物種的磷酸丙糖異構(gòu)酶都一定的同源性。
　　 2.捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的原核表達(dá)及重組酶活性測(cè)定
　　 應(yīng)用DNA重組技術(shù),將TPI

5、的ORF克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中,經(jīng)酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組HcTPI蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,pET32a(+)-HcTPI在大腸桿菌中得到成功表達(dá),重組蛋白分子量在45kDa左右。菌體經(jīng)超聲破碎后的沉淀與上清的SDS-PAGE分析結(jié)果表明,融合蛋白在上清和包涵體中均有表達(dá)。以感染捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)山羊的血清作為第一抗體,兔抗山羊IgG-HRP為第二抗體進(jìn)行weste

6、rn blot分析,結(jié)果顯示在45kDa處出現(xiàn)特異性條帶。采用與α-磷酸甘油脫氫酶偶聯(lián)法對(duì)該重組蛋白進(jìn)行酶活性測(cè)定,結(jié)果表明其最適反應(yīng)溫度為40℃,pH值為7.5。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示,Km和Vmax分別為0.96mmol/L和0.341 mmol/(L·min)。
　　 3.捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶的原核表達(dá)及重組酶的活性測(cè)定
　　 將表達(dá)捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶(HcGDH)的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Hc

7、GDH轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,pET-28a(+)-HcGDH在大腸桿菌中得到成功表達(dá),融合蛋白分子量在63kDa左右。菌體經(jīng)超聲破碎,對(duì)沉淀與上清進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果表明重組蛋白以包涵體的形式存在。用His蛋白純化柱對(duì)該包涵體蛋白變性純化后,用梯度尿素對(duì)其進(jìn)行連續(xù)透析復(fù)性。對(duì)純化復(fù)性的蛋白進(jìn)行谷氨酸脫氫酶活性測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶為NAD特異性酶且最適反應(yīng)溫度和pH分