新一代聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶基礎研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌細胞是精氨酸營養(yǎng)缺陷型細胞，精氨酸脫亞胺酶(arginine deiminase，ADI)可分解精氨酸，使肝癌細胞失去營養(yǎng)供給而死亡，卻不影響正常細胞的生長。本課題擬研制新一代聚乙二醇(PEG)修飾的ADI，并完成該藥物生物學特性的基礎研究。 方法：采用了全基因合成的方式，以大腸桿菌偏愛的密碼子來設計并合成ADI的全基因。構建原核表達載體pET3a—ADI，轉化大腸桿菌BL21DE3(pLyss)，篩選陽性克隆I

2、PTG誘導發(fā)酵4小時。發(fā)酵液離心，收集菌體，高壓勻漿破碎后離心。用PBS洗滌包涵體，包涵體增溶復性后，經(jīng)陰離子交換層析，疏水層析和精氨酸親和層析法純化目標蛋白。采用體外精氨酸降解試驗測定酶的活性?？刂芇EG修飾基本反應條件，以新一代PEG修飾技術修飾rADI，修飾后的產物PEG—rADI用疏水柱ResourcePHE純化。用Fe(SCN)法測定PEG修飾率?；钚詼y定方法與rADI的一致。分別用體外肝癌細胞抑制試驗、H22移植瘤模型藥效試

3、驗、正常鼠免疫原性試驗完成PEG—rADI的動物體內、外生物學實驗。 結果：成功構建了原核表達載體pET3a—ADI，通過改進發(fā)酵工藝，增加目標蛋白的百分表達率。優(yōu)化ADI發(fā)酵產物的包涵體復性工藝，使復性收率提高到40％以上?；钚詼y定表明，純化后rADI的比活性達到40IU/mg。新一代PEG修飾的ADI降低了ADI的免疫原性，其酶活力與其修飾率有關。動物體內、體外生物學預實驗結果表明：抑瘤效果與美國鳳凰制藥公司研制的PEG—A