RIP1激酶參與缺血性腦中風誘導的星形膠質細胞增生及膠質瘢痕的形成.pdf

1、目的：
　　研究necroptosis死亡的關鍵激酶RIP1K（receptor interaction protein1 kinase,RIP1K）在缺血性腦中風誘導的星形膠質細胞增生及膠質瘢痕形成中的作用，并研究其作用機制是否與調節(jié)星形膠質細胞的VEGFD-VEGFR3信號通路有關。
　　方法：
　　采用大鼠短暫性大腦中動脈阻塞（transient middle cerebral artery occlusion,

2、tMCAO）方法，建立大鼠星形膠質細胞增生及膠質瘢痕模型。模型前5天側腦室注射慢病毒沉默RIP1K基因，以腦萎縮體積、行為學癥狀等指標評價大鼠腦中風后期的神經(jīng)功能恢復情況。采用原代培養(yǎng)的新生大鼠皮層星形膠質細胞氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation,OGD）再灌注的方法，建立體外星形膠質細胞增生及膠質瘢痕形成的細胞模型。星形膠質細胞與神經(jīng)元co-culture法檢測RIP1K基因沉默對神經(jīng)元軸突的影響。LDH方法

3、檢測OGD再灌注誘導的星形膠質細胞乳酸脫氫酶漏出率。免疫熒光法、western blot法檢測體內(nèi)體外缺糖缺氧再灌注對星形膠質細胞增生及膠質瘢痕形成的標志蛋白GFAP、neurocan以及phosphacan表達情況。Western blot法及免疫熒光法觀察星形膠質細胞RIP1K、VEGFD、VEGFR3表達情況。
　　結果：
　　術前5天給予RIP1K基因沉默病毒可有效減少tMCAO誘導的大鼠膠質瘢痕的形成，減少腦中風2

4、8天后腦萎縮體積（P＜0.01）,及改善行為學癥狀（P＜0.01）。Western blot結果顯示：tMCAO后皮層缺血區(qū)膠質瘢痕標志蛋白GFAP、neurocan、phosphacan以及RIP1K表達上調（P＜0.01）。在RIP1K基因沉默后，免疫組化顯示sh RIP1K可抑制皮層缺血區(qū)膠質瘢痕標志蛋白 GFAP、neurocan、表達上調以及VEGFD、VEGFR3表達的上調（P＜0.01）。在星形膠質細胞氧糖剝奪再灌注的體外

5、星形膠質細胞增生及膠質瘢痕模型，Western Blot結果顯示：星形膠質細胞在OGD再灌注后，膠質瘢痕的標志蛋白GFAP、neurocan、phosphacan以及RIP1K、VEGFD、VEGFR3表達上調（P＜0.01），Elisa結果顯示：在星形膠質細胞OGD/再灌注后，星形膠質細胞以及培養(yǎng)基中 VEGFD表達較正常組均增加。RIP1K基因沉默可對抗OGD/再灌注引起的星形膠質細胞GFAP、neurocan、phosphacan

6、、RIP1K表達變化，并減少VEGFD、VEGFR3表達的上調（P＜0.01）。在星形膠質細胞OGD/再灌注膠質瘢痕模型與神經(jīng)元共培養(yǎng)系統(tǒng)中，LDH結果顯示：RIP1K基因沉默可以抑制OGD/再灌注誘導的細胞乳酸脫氫酶漏出率（P＜0.01），促進神經(jīng)元軸突的延伸（P＜0.01）。
　　結論：
　　1.抑制RIP1K可以促進缺血性腦中風后期神經(jīng)功能的恢復，其作用可能與RIP1K基因沉默抑制星形膠質細胞增生及膠質瘢痕的形成有關。