低氧誘導因子-1α對缺血-再灌注心肌線粒體的保護作用研究.pdf

1、線粒體在心肌缺血-再灌注損傷（Myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI）所致的心肌細胞凋亡及心臟收縮功能障礙中起關鍵作用。再灌注期間，鈣超載，自由基生成增加可致線粒體通透性轉換孔(Mitochondrial permeability transition pore， mPTP）開放，從而引起線粒體膜電位丟失，促凋亡蛋白釋放，ATP耗盡，最終細胞凋亡，心肌收縮功能降低。因此，抑制線粒體功能障

2、礙是減輕MI/RI的有效途徑。
　　線粒體內蛋白是線粒體功能的主要調控者，在維持線粒體結構和功能的完整性中發(fā)揮關鍵作用。如附圖1所示，線粒體中Bcl-2和Bax均可調節(jié)mPTP開放，且兩者比值失衡可激活線粒體凋亡通路；與線粒體結合的己糖激酶Ⅱ（Hexokinase，HKⅡ）能有效抑制 Bax與 mPTP的促凋亡作用；而位于線粒體內膜的解偶聯(lián)蛋白3（uncoupling protein3，UCP3）可促進HKⅡ與線粒體結合。另外，U

3、CP3可通過調控H+穩(wěn)態(tài)參與線粒體的ATP合成，從而直接影響I/R中心肌收縮功能的恢復。
　　低氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）作為氧敏感的轉錄因子，可通過轉錄激活多種基因來發(fā)揮機體對低氧或缺血的適應性反應。目前研究已明確HIF-1α具有改善急性MI/RI的作用，但其潛在機制尚未完全闡明。經我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可通過抑制心肌細胞凋亡來減輕MI/RI，且對caspa

4、se-3與caspase-9活性具有明顯抑制效應，而對caspase-8活性無影響，表明HIF-1α可抑制線粒體凋亡信號通路介導的心肌細胞凋亡。然而，HIF-1α的抗MI/RI作用是否與調控線粒體有關，目前尚不清楚。因此，本研究擬在大鼠心肌I/R模型上，探索HIF-1α能否改善線粒體功能障礙及其保護線粒體的可能機制。
　　目的：
　　1．通過觀察HIF-1α對I/R大鼠心臟收縮功能及心肌組織線粒體結構和功能的影響，以確定HI

5、F-1α的抗MI/RI作用是否與保護線粒體有關。
　　2．探討HIF-1α保護線粒體的可能機制。
　　方法：
　　1. SPF級雄性SD大鼠112只，隨機分為四組：Sham組、心肌缺血/再灌注+生理鹽水（MI/R+V）組、DMOG（HIF-1α活化劑，40mg/kg，術前24h腹腔注射）+心肌缺血/再灌注（D+MI/R）組、環(huán)孢素A（mPTP特異性抑制劑，10mg/kg/d，灌胃1周）+心肌缺血/再灌注（CsA+MI/

6、R）組。除Sham組外，其余三組均結扎左前降支45min，再灌注3h。
　　2.分別采用右側頸總動脈插管和小動物超聲心動儀（再灌注24h后做超聲心動圖）檢測血流動力學指標和左心室活動情況。
　　3.再灌3h后取左心室心尖部心肌組織，透射電鏡下觀察心肌組織線粒體的超微結構；采用組織線粒體分離試劑盒提取再灌注10min后的心肌組織線粒體，并用線粒體膜通道孔比色法檢測試劑盒測定mPTP開放程度；再灌注3h后按試劑盒方法提取心肌組織

7、線粒體，并用線粒體活體染色劑詹納斯綠B對其進行形態(tài)鑒定，分別采用JC-1熒光探針和螢火蟲熒光素酶定量法，檢測線粒體膜電位和心肌組織ATP含量。
　　4.再灌注3h后留取左心室結扎線下方的心尖部心肌組織，分離心肌組織的線粒體和胞漿蛋白以及總蛋白，采用western blot法對線粒體凋亡通路蛋白Bcl-2和Bax及HKⅡ、UCP3蛋白表達水平進行定量檢測。
　　結果：
　　1. HIF-1α可逆轉I/R所致的心功能降低<

8、br>　　與Sham組相比，MI/R+V組大鼠的左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室內壓最大上升速率（dp/dt max）、左室內壓最大下降速率（-dp/dt max）絕對值及左心室射血分數(shù)（EF）與縮短分數(shù)（FS）明顯降低（P<0.05）；與MI/R+V組相比，D+MI/R組大鼠的LVSP、LVEDP、dp/dtmax、-dp/dtmax絕對值顯著升高（P<0.05），且EF與FS明顯增加（P<0.05）。

9、　　2. HIF-1α可明顯改善I/R所致的線粒體損傷
　　透射電鏡結果顯示，MI/R+V組大鼠心肌組織的線粒體腫脹，外膜結構模糊，部分線粒體外膜破裂，嵴稀疏并呈現(xiàn)嵴斷裂、消失；而D+MI/R組與CsA+MI/R組線粒體外膜結構及嵴疏密程度等超微結構明顯優(yōu)于MI/R+V組，但劣于Sham組。在線粒體功能檢測方面，熒光顯微鏡與熒光酶標儀定量檢測結果顯示，與Sham組比較，MI/R+V組大鼠心肌線粒體膜電位顯著下降，紅色與綠色熒光強度

10、的比值較Sham組低80.81％（P<0.05）；與MI/R+V組比較，D+MI/R組與CsA+MI/R組線粒體膜電位顯著增強，紅色與綠色熒光強度的比值較MI/R+V組分別高2.2倍，2.5倍（P<0.05）。與Sham組相比，MI/R+V組大鼠心肌組織線粒體mPTP吸光值比值（A540/Initial A540）降低，心肌組織ATP含量降低74.49%（P<0.05）；與MI/R+V組相比，D+MI/R組與CsA+MI/R組心肌組織線

11、粒體A540/Initial A540比值增加，心肌組織ATP含量分別增加1.9倍，2.0倍（P<0.05）。
　　3. HIF-1α可調控I/R心肌線粒體相關蛋白的表達
　　Western blot結果顯示，與Sham相比，MI/R+V組大鼠心肌線粒體中Bcl-2、HKⅡ蛋白表達量均降低，Bax蛋白表達量顯著升高（P<0.05），而胞漿中Bcl-2、HKⅡ蛋白表達量均增加，Bax蛋白表達量降低（P<0.05），且心肌組織中

12、UCP3蛋白表達量明顯降低（P<0.05）；與MI/R+V組相比，D+MI/R組與CsA+MI/R組能顯著上調心肌線粒體中Bcl-2、HKⅡ蛋白表達水平（P<0.05），明顯減少胞漿中Bcl-2、HKⅡ蛋白表達量（P<0.05），并抑制Bax蛋白從胞漿向線粒體移位（P<0.05），且D+MI/R組心肌組織中HIF-1α和UCP3蛋白表達量顯著增加（P<0.05）。
　　結論：
　　1．HIF-1α減輕大鼠MI/RI的作用與顯