開放MitK-,ATP-通道對缺血再灌注心肌保護(hù)作用研究.pdf

1、心臟直視手術(shù)中，心肌缺血性損傷和再灌注損傷是影響術(shù)后心臟功能恢復(fù)的重要因素，心肌保護(hù)一直是心血管外科領(lǐng)域的研究重點。隨著近年來對心肌ATP敏感鉀離子通道研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)開放心肌KATP通道可對缺血再灌注心肌起到重要的保護(hù)作用，逐漸成為心肌保護(hù)研究新的熱點。 研究發(fā)現(xiàn)：心肌線粒體和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的損傷在缺血再灌注損傷機(jī)制中起重要的作用。心臟直視手術(shù)中心肌缺血及再灌注可導(dǎo)致線粒體和內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能紊亂，從而通過不同途徑引起

2、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)。由此可以推斷，圍手術(shù)期加強對心肌線粒體和內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)，可以減輕心肌缺血再灌注損傷，促進(jìn)術(shù)后心臟功能的恢復(fù)。國內(nèi)外研究提示K+通道開放劑預(yù)處理可能減輕心肌缺血再灌注損傷，改善心肌保護(hù)效果。 目的：本研究通過動物模型的制備，觀察線粒體K+通道開放劑二氮嗪對缺血再灌注心肌線粒體、內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，以及心肌結(jié)構(gòu)和功能的影響，探討其心肌保護(hù)作用及機(jī)制。 方法：本研究采用Langendorff離體心臟灌注模型

3、和大鼠離體工作心臟灌注模型，分三部分進(jìn)行。第一部分，SD大鼠50只，隨機(jī)分為五組，制備Langendorff大鼠離體心臟灌注模型，A組為正常對照；B組停灌30min，復(fù)灌30min；其余各組分別灌注不同的停搏液：C組灌注高鉀停搏液；D組灌注含二氮嗪的停搏液；E組灌注含二氮嗪停搏液之前10min給予格列苯脲。實驗終了取心肌組織，部分心肌制病理切片，電鏡下觀察線粒體改變；部分心肌用差速離心法提取線粒體并進(jìn)行檢測。采用紫外分光光度法檢測細(xì)胞色

4、素氧化酶活性，RT-PCR檢測其mRNA表達(dá)變化；分別采用定磷法、高效液相法、激光共聚焦顯微鏡掃描、免疫組化和放免法檢測H+-ATP酶活性、心肌ATP含量、線粒體膜電位、細(xì)胞色素C含量、自由基生成。第二部分，新西蘭白兔50只，隨機(jī)分組，制備Langendorff離體心臟灌注模型。A組為正常對照；B組停灌30min，復(fù)灌30min；其余各組分別灌注不同的灌注液：C組灌注含血灌注液；D組灌注含二氮嗪的含血灌注液；E組灌注含二氮嗪灌注液之前1

5、0min給予格列苯脲。實驗終了取心肌組織，免疫組化檢測細(xì)胞間粘附分子-1表達(dá)；RT-PCR檢測其細(xì)胞間粘附分子-1mRNA表達(dá)變化；放免法檢測腫瘤壞死因子-a、一氧化氮、血小板活化因子、髓過氧化物酶、內(nèi)皮素-1表達(dá)。各組收集冠脈流出液。第三部分，SD大鼠50只，制備離體工作心臟灌注模型。A組待心臟穩(wěn)定搏動后，記錄心率、左室收縮峰壓和舒張末壓，并取心??；B組停灌30min，復(fù)灌30min；其余各組分別灌注不同的停搏液：C組灌注停搏液；D組

6、灌注含二氮嗪的停搏液；E組灌注含二氮嗪停搏液之前10min給予格列苯脲。各組復(fù)灌30min后，監(jiān)測心率、左室收縮峰壓和舒張末壓，+dp/dtmax以及-dp/dtmax。實驗終了取心肌組織，病理切片觀察心肌損傷。 結(jié)果1.B組心肌線粒體膜電位、細(xì)胞色素氧化酶活性及其mRNA含量、H+-ATP酶活性降低、ATP生成降低(P＜0.01)；C組明顯升高(P＜0.01)；而D組較C組也有明顯升高(P＜0.05)，E組較D組則顯著降低。B

7、組心肌線粒體鈣離子含量增加、細(xì)胞色素C釋放增加、自由基生成增加(P＜0.01)；C組與E組則顯著降低(P＜0.01)；而D組較C、E組也有明顯降低(P＜0.05)。 2.B組缺血再灌注心肌線粒體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為：數(shù)目明顯減少，膜結(jié)構(gòu)不清晰，腫脹，部分線粒體出現(xiàn)空泡，嵴減少，結(jié)構(gòu)不清，斷裂，部分消失。C組與E組線粒體結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，而D組線粒體結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步改善。 3.B組心肌腫瘤壞死因子-a、細(xì)胞間粘附分子-1及其mR

8、NA、血小板活化因子、髓過氧化物酶、內(nèi)皮素-1含量明顯增高(P＜0.01)；C組與E組則顯著降低(P＜0.01)；而D組較C、E組也有明顯降低(P＜0.05)。B組一氧化氮表達(dá)及冠狀動脈流量較A組顯著降低(P＜0.01)，C、E組與B組相比有明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。D組心肌一氧化氮含量及冠狀動脈流量較C組也有明顯升高(P＜0.01)，與正常組已無顯著性差異。 4.B組缺血再灌注心肌內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為：水

9、腫明顯，空泡形成，且大小不等，管腔內(nèi)膜結(jié)構(gòu)連續(xù)不佳，內(nèi)皮細(xì)胞基底膜完整，核變形。C組與E組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，而D組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步改善。 5.B組+dp/dtmax、-dp/dtmax及左室發(fā)展壓較A組顯著降低(P＜0.01)，C組與B組相比有明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。D組心肌左室發(fā)展壓含量較B組也有明顯好轉(zhuǎn)(P＜0.01)，與正常無明顯差異(P＞0.05)，與C組及E組相比有顯著差異(P＜0.0

10、5)。 結(jié)論1.動物模型的建立：采用SD大鼠以及新西蘭白兔，利用離體心臟灌注系統(tǒng)，可制備Langendroff離體心臟灌注模型和離體工作心臟灌注模型，操作簡便，模型穩(wěn)定可靠。 2.心肌缺血再灌注時線粒體結(jié)構(gòu)損傷、功能失調(diào)，表現(xiàn)為：線粒體膜電位降低、細(xì)胞色素C向胞漿內(nèi)釋放增加、線粒體鈣離子含量增高、氧自由基產(chǎn)生增加、線粒體氧化還原酶活性降低、心肌ATP含量降低。常規(guī)高鉀停搏液可減輕線粒體損傷，而二氮嗪處理可進(jìn)一步減輕損傷，

11、改善線粒體功能。 3.心肌缺血再灌注時冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、功能失調(diào)，表現(xiàn)為：細(xì)胞間粘附分子-1、腫瘤壞死因子-a等炎癥介質(zhì)表達(dá)增加，中性粒細(xì)胞向心肌組織內(nèi)浸潤增加、血管舒張因子NO含量降低、血小板活化因子、內(nèi)皮素-1等血管收縮物質(zhì)增加，冠狀動脈流量降低。常規(guī)高鉀停搏液可減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而二氮嗪處理可進(jìn)一步減輕損傷，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。 4.心肌缺血再灌注時心肌結(jié)構(gòu)損傷，收縮、舒張功能，心臟作功降低。常規(guī)高鉀停搏液可