Notch信號途徑對缺血-再灌注心肌的保護作用.pdf

1、【背景】
　　缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,I/RI)是指組織器官長時間缺血后,恢復血液供應時組織器官功能上的損傷不能得到恢復,反而被加重。許多臨床案例證明僅僅缺血不足以導致組織損傷,而是在缺血一段時間后又突然恢復血供時才出現(xiàn)損傷。在創(chuàng)傷性休克、器官移植、血栓等血液循環(huán)障礙時,都會出現(xiàn)缺血后再灌注損傷。缺血性心臟病是全球主要死亡原因之一,嚴重威脅著公眾健康。要挽救缺血心肌就必須及時、有效

2、的恢復缺血心肌的血流。但是,臨床發(fā)現(xiàn)有一部分病例在手術(shù)成功恢復缺血心肌血供后,卻導致心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)損傷致使病情反而惡化,出現(xiàn)進行性心功能下降,甚至發(fā)生致死性心率失常。關(guān)于MI/R損傷的影響有三個方面:心肌超微結(jié)構(gòu)的變化、心肌能量代謝的變化以及心功能的變化。再灌注后由于恢復供氧而產(chǎn)生活性氧族(reactive oxygen species,ROS)增多,鈣離子超

3、載及炎癥反應等均是引起MI/R損傷的機制,并直接或間接引起心肌細胞凋亡和壞死。
　　Notch信號途徑是影響細胞命運的保守信號轉(zhuǎn)導通路,決定著成年動物組織和器官正常結(jié)構(gòu)和功能的維持及其受損后的修復。以哺乳動物為例,經(jīng)典 Notch信號通路由5種配體(Delta-like1,3,4和Jagged1,Jagged2)和4種受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)組成,當相鄰細胞間的Notch受體和配體相互作用后,

4、Notch受體的跨膜區(qū)依次在ADAM金屬蛋白酶和具有γ分泌酶活性的Presenilin或Nicastrin的作用下從近膜處裂解,釋放出Notch胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain,NICD)并進入細胞核內(nèi)。進入核內(nèi)的NICD可通過RAM結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J(recombination signal binding protein J)相互作用,激活含有RBP-J識別位點的啟動子的轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)細胞分化相關(guān)

5、基因的表達。目前,僅有極少一部分RBP-J下游靶基因得到鑒定。最常見的下游靶基因是bHLH類轉(zhuǎn)錄因子,如Split家族Hairy增強子(hairy/Enhancer of split,Hes)等。在哺乳動物的四種Notch受體都需要RBP-J來介導轉(zhuǎn)錄激活活性。有文獻顯示,外界刺激使細胞產(chǎn)生 Notch信號途徑的應答,在肝臟和腦缺血性損傷中Notch信號途徑都有參與。在MI/R損傷的過程時,Notch信號途徑是否參與其中?Notch信號

6、途徑在此過程中起到什么作用?Notch信號途徑發(fā)揮作用的具體分子機制是什么?對這些問題的研究將進一步完善MI/R損傷的分子調(diào)控理論體系,可為MI/R損傷的預防提供理論基礎,更可為MI/R損傷相關(guān)的治療提供新的視角。
　　【目的】
　　研究Notch信號途徑在MI/R損傷中的作用,觀察缺氧/復氧后Notch信號途徑相關(guān)分子的變化,以及Notch信號途徑是否影響ROS的生成。為探索MI/R損傷的分子調(diào)控機制,及為缺血性心臟病的防

7、治提供一個嶄新的策略和途徑。
　　【方法】
　　1.H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌細胞的培養(yǎng)應用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),當細胞近匯合時,用2.5 g/L胰酶消化,將H9C2(2-1)細胞按1:2～1:4傳代。在實驗前1 d,細胞培養(yǎng)換為含20 ml/L胎牛血清的培養(yǎng)基,使H9C2(2-1)細胞向心肌細胞分化。
　　2.原代乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)無菌條件下取出1～3 d的SD乳鼠心臟,剪碎,加入含

8、1.0 g/L膠原酶Ⅰ的消化液,于37℃水浴3～5 min,反復吹打,靜置,棄去上清液。于沉淀中再加入消化液,置37℃水浴中約5 min,反復吹打后,將上清移至含100 ml/L胎牛血清及0.1 mmol Brdu的完全培養(yǎng)基(含10％胎牛血清100U/ml青霉素及0.1mg/ml鏈霉素的DMEM)中。重復上述步驟,直至所有組織都被完全消化。離心取沉淀并重懸于完全培養(yǎng)基中。差速貼壁90~120 min,將細胞懸液移至培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中,加

9、入含0.1 mmol/L Brdu的完全培養(yǎng)基。每24 h換1次液。換液時,觀察細胞形態(tài),若由圓形變成梭形或不規(guī)則形,由靜止變成有規(guī)律的收縮時進行實驗。
　　3.實驗分組將心肌細胞分為兩個組,即缺氧/復氧(H/R)組和常氧組。H/R組的細胞用無糖無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于低氧罐中培養(yǎng)6 h,隨后換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h,常氧組的細胞使用含100 ml/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩組又分為對照組、DMSO組及GSI(

10、Notch信號阻斷劑)組。
　　4.體外應用GSI阻斷Notch信號在心肌細胞缺氧處理前一天加GSI75μmol/L按1:3000溶于完全培養(yǎng)基中。觀察阻斷Notch信號途徑對MI/R損傷的影響。
　　5.利用Real-time PCR檢測Notch信號途徑相關(guān)分子mRNA的表達水平應用 RNA提取試劑盒提取乳鼠原代心肌細胞總 RNA,并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將之反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應體系為2×qPCR TaqMix12.5μl、1

11、0μmol/L擴增Notch1、Jagged1、Hes1基因的正反向引物序列的混合物0.5μl,對應的cDNA各1μl,補加水至25μl,并設不加模板的陰性對照(2×qPCR TaqMix12.5μl、10μmol/L擴增Notch1、Jagged1、Hes1基因的正反向引物序列的混合物0.5μl,補加水至25μl)。用熒光定量PCR儀擴增,PCR的反應條件為:95℃5 min預變性后,95℃15 s→60℃35 s(熒光檢測),共40

12、個循環(huán)。并對PCR的產(chǎn)物進行了電泳分析。
　　6.Notch信號途徑相關(guān)分子的Western blot檢測從培養(yǎng)的乳鼠原代心肌細胞中提取蛋白,測定蛋白濃度后,進行 SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至聚偏[二]氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脫脂奶粉封閉1 h。加1:500兔抗Notch1、1:200山羊抗Hes1或1:1000小鼠抗β-Tubulin抗體,4℃孵育過夜,用TBST洗膜,再分別用1:4000的HPR標記山羊抗兔、?？股窖?/p>

13、及山羊抗小鼠IgG,于37℃孵育1 h。洗滌后用增強型化學發(fā)光液(ECL)顯色后,采用Quantity One分析軟件進行信號采集并進行灰度掃描。
　　7.細胞凋亡的檢測將H9C2(2-1)細胞接種到蓋玻片上,低氧/復氧結(jié)束后,嚴格按照TUNEL試劑盒的使用說明進行細胞染色,并用DAPI進行細胞核染色。陽性標準為:凋亡細胞呈綠色,表示凋亡陽性細胞,藍色為細胞核。觀察凋亡細胞的個數(shù),用400倍顯微鏡觀察每張玻璃片中凋亡細胞的個數(shù),每

14、張玻片隨機選取10個視野進行細胞計數(shù),每組計數(shù)100個視野,結(jié)果以其均值表示。凋亡指數(shù)(AI)為凋亡細胞的數(shù)占細胞核總數(shù)(細胞總數(shù))的百分比表示。染色及細胞計數(shù)均采用雙盲法。
　　8.ROS水平的熒光探針DCFH-DA檢測采用胰酶消化的貼壁H9C2(2-1)細胞。將探針溶液在新的DMEM培養(yǎng)基中稀釋到所需濃度作為染色液,以染色液更換細胞培養(yǎng)液,在37℃避光孵育20 min(每隔5 min搖動細胞)。孵育結(jié)束后,用新鮮DMEM培養(yǎng)基

15、洗滌細胞。加0.5~1 ml冰冷PBS的重懸細胞(5~10萬個),采用流式細胞儀于488 nm波長激發(fā),測定波長大于525 nm的發(fā)射光,可將細胞分成兩個亞群:ROS陰性的細胞僅有很低的熒光強度;ROS陽性的細胞具有較強的熒光。
　　9.統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以x±s表示,用origin8軟件進行統(tǒng)計學分析。多組間比較采用ANOVA,兩組間差異比較采用組間t檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　【結(jié)果】
　　1.阻斷N

16、otch信號途徑會導致MI/R損傷加重。用TUNEL染色法檢測細胞凋亡水平,用LDH檢測細胞損傷,體外結(jié)果顯示H/R顯著增加心肌細胞凋亡率和心肌損傷,應用GSI阻斷Notch信號途徑后心肌細胞凋亡率和損傷水平進一步增加。
　　2.阻斷Notch信號途徑可使MI/R損傷中心肌細胞的ROS水平增加。用熒光探針DCFH-DA檢測心肌細胞ROS水平,體外結(jié)果顯示H/R使心肌細胞ROS水平顯著增加,應用GSI阻斷Notch信號途徑后進一步促

17、進H/R心肌細胞ROS的生成。
　　3.MI/R損傷時Notch信號途徑中各分子的基因表達反應性上調(diào)。H/R可使心肌細胞中Notch信號途徑的受體基因Notch1的水平及心肌細胞中配體基因Jagged1的水平顯著升高,加入GSI后,受體Notch基因和配體Jagged1基因的水平,并沒有顯著改變。H/R可使心肌細胞中Notch信號途徑下游轉(zhuǎn)錄基因Hes1的水平顯著升高,加入GSI后,可顯著降低Hes1基因的水平。
　　4.M

18、I/R損傷時 Notch信號途徑中蛋白水平的表達反應性上調(diào)。體外結(jié)果顯示H/R可顯著增加NICD1和Notch信號下游轉(zhuǎn)錄因子Hes1的蛋白表達水平;加入GSI后,并未影響NICD1的蛋白水平,但Hes1的蛋白表達水平受到明顯抑制,顯著下降。
　　5.應用H9C2(2-1)細胞分別與OP9-Dll1或OP9-GFP共培養(yǎng)的方法,激活Notch信號途徑,熒光探針DCFH-DA檢測法和細胞流示圖觀察心肌細胞中ROS的水平。結(jié)果顯示,激

19、活Notch信號途徑組:OP9-Dll1與對照組:OP9-GFP相比較,H/R后OP9-Dll1組心肌細胞中ROS的水平顯著降低,說明激活Notch信號途徑可能抑制ROS的生成。
　　6.LDH細胞活性檢測結(jié)果顯示心肌細胞損傷水平:H/R組細胞損傷水平明顯比常氧組多。給予GSI抑制Notch信號途徑后,可進一步加重H/R導致的心肌損傷;給予NAC清除ROS,H/R后細胞損傷水平顯著降低。說明Notch信號途徑是通過抑制ROS生成,

20、來降低H/R后細胞損傷。
　　總之,本實驗檢測了H/R心肌細胞中Notch信號途徑分子表達的水平,觀察了抑制Notch信號途徑對Notch信號分子的表達,提示Notch信號途徑在MI/R時反應性的上調(diào),可能是細胞的代償性保護反應。進一步檢測心肌細胞凋亡水平的變化,發(fā)現(xiàn)H/R時可顯著提高心肌細胞凋亡的水平,并在給予GSI阻斷Notch信號途徑后細胞凋亡的水平進一步增加,間接說明 Notch信號途徑可能對缺血心肌具有保護作用。進一步研

21、究發(fā)現(xiàn),給予GSI后,通過抑制Notch信號途徑可增加H/R心肌細胞中 ROS的生成,并導致細胞損傷。激活 Notch信號途徑,ROS的生成降低。給予NAC后,通過清除ROS,可減少細胞損傷。該結(jié)果說明,激活Notch信號途徑,可能通過抑制ROS生成降低MI/R損傷。
　　【結(jié)論】
　　1.Notch信號阻斷后會引起心肌缺血/再灌注損傷加重,表明Notch信號途徑在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。抑制Notch信號途