LncRNA CARLo-5對(duì)食管癌生物學(xué)特性的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：CARLo-5在食管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)其生物學(xué)特性的影響
　　目的：研究癌癥相關(guān)區(qū)域長(zhǎng)鏈非編碼RNA CARLo-5在食管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和周期的影響。
　　方法：
　　1.應(yīng)用 Realtime-PCR法檢測(cè)食管癌組織、癌旁組織以及食管癌細(xì)胞中LncRNA CARLo-5的表達(dá)。
　　2.應(yīng)用MTS法、Transwell遷移、Matrigel侵襲和劃痕愈合

2、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低/過(guò)表達(dá)CARLo-5基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖活性、侵襲和遷移能力的影響。
　　3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CARLo-5對(duì)KYSE30和KYSE180細(xì)胞周期和早期凋亡的影響。
　　4.應(yīng)用 MTS和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CARLo-5在 KYSE30和 KYSE180細(xì)胞中對(duì)5氟尿嘧啶藥物敏感性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，食管癌組織中CARLo-5表達(dá)水平顯

3、著上調(diào)（P<0.05）；與正常食管上皮細(xì)胞相比，多種食管癌細(xì)胞中CARLo-5表達(dá)水平上調(diào)（P<0.05）。
　　2.MTS檢測(cè)結(jié)果顯示，敲低 CARLo-5基因可抑制 KYSE30和KYSE180細(xì)胞的增殖活性（P<0.05）；而過(guò)表達(dá)CARLo-5基因?qū)YSE30和KYSE180細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用（P<0.05）。Transwell和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低 CARLo-5基因能抑制食管癌 KYSE30和 KYSE18

4、0細(xì)胞遷移和侵襲能力（P<0.05），過(guò)表達(dá)CARLo-5基因能夠促進(jìn)KYSE30和KYSE180細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低CARLo-5基因后KYSE30和KYSE180細(xì)胞的早期凋亡率增高（P<0.05）；G1期細(xì)胞比例均顯著增加（P<0.05），S期細(xì)胞比例均顯著降低（P<0.05）。
　　4.MTS分析結(jié)果顯示，敲低 CARLo-5基因可降低 KYSE3

5、0和KYSE180細(xì)胞對(duì)5氟尿嘧啶的藥物敏感性（P<0.05）；流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CARLo-5基因可降低5氟尿嘧啶處理后的KYSE30和KYSE180細(xì)胞凋亡率（P<0.05）。
　　第二部分： CARLo-5對(duì)食管癌細(xì)胞作用機(jī)制研究
　　目的：研究CARLo-5與蛋白和microRNA相互作用的機(jī)制從而探討CARLo-5發(fā)揮的促癌作用的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用Western blot

6、法檢測(cè)敲低CARLo-5基因表達(dá)對(duì)食管癌KYSE30和KYSE180細(xì)胞周期、侵襲遷移、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。
　　2.應(yīng)用RNA pulldown實(shí)驗(yàn)、質(zhì)譜檢測(cè)、RIP實(shí)驗(yàn)及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CARLo-5能否與PTBP1結(jié)合。
　　3.應(yīng)用 MTS法、Transwell遷移法檢測(cè)敲低 PTBP1基因，過(guò)表達(dá)CARLo-5基因同時(shí)敲低PTBP1基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖活性和遷移能力的影響。
　　4.應(yīng)

7、用 Western blot法檢測(cè)食管癌細(xì)胞經(jīng)放線菌酮處理后，或經(jīng)Mg132聯(lián)合放線菌酮處理后，過(guò)表達(dá)CARLo-5基因?qū)TBP1蛋白表達(dá)水平的影響。
　　5.應(yīng)用Western blot法檢測(cè)敲低PTBP1基因?qū)YSE30和KYSE180細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。
　　6.應(yīng)用Realtime-PCR法檢測(cè)食管癌細(xì)胞中敲低和過(guò)表達(dá)CARLo-5基因后不同microRNA的表達(dá)變化，并篩選出差異顯著的

8、miR-218-5p進(jìn)行后續(xù)研究。
　　7.應(yīng)用MTS法、Transwell遷移、Matrigel侵襲和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低/過(guò)表達(dá)miR-218-5p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖活性、侵襲和遷移能力的影響。
　　8.應(yīng)用MTS法、Transwell遷移法檢測(cè)過(guò)表達(dá)CARLo-5基因同時(shí)敲低miR-218-5p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。
　　9.應(yīng)用Realtime-PCR法檢測(cè)食管癌細(xì)胞中敲低和過(guò)表達(dá)miR-218-5p

9、后靶基因的表達(dá)變化，并篩選出差異顯著的靶基因進(jìn)行后續(xù)研究。
　　10.應(yīng)用Western blot法檢測(cè)敲低和過(guò)表達(dá)miR-218-5p后對(duì)KYSE30和KYSE180細(xì)胞ROBO1、BMI1、RELN蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低 CARLo-5可誘導(dǎo) KYSE30和KYSE180周期相關(guān)蛋白cyclinB1、cyclinD1、CDK2、CDK4表達(dá)水平降低，P2

10、1表達(dá)水平增高（P<0.05）；侵襲遷移相關(guān)蛋白 MMP9和 MMP2表達(dá)水平降低（P<0.05）；凋亡相關(guān)蛋白MCL-1表達(dá)水平降低（P<0.05）， Caspase-3表達(dá)水平增高（P<0.05）。
　　2.RNA pulldown、聯(lián)合質(zhì)譜分析、RIP和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， CARLo-5在食管癌細(xì)胞中能夠與PTBP1蛋白相結(jié)合。
　　3.MTS法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低 PTBP1基因可抑制

11、KYSE30和 KYSE180細(xì)胞增殖（P<0.05）；Transwell遷移結(jié)果顯示，敲低PTBP1基因可抑制KYSE30和KYSE180細(xì)胞遷移能力（P<0.05）。
　　4.MTS法檢測(cè)結(jié)果顯示，敲低PTBP1基因能夠降低CARLo-5過(guò)表達(dá)對(duì)KYSE30和KYSE180細(xì)胞增殖的增強(qiáng)作用（P<0.05）；Transwell遷移結(jié)果顯示，敲低 PTBP1基因能夠降低 CARLo-5過(guò)表達(dá)對(duì) KYSE30和KYSE180細(xì)胞遷

12、移能力的增強(qiáng)作用（P<0.05）。
　　5.Western blot法分析結(jié)果顯示， KYSE30和KYSE180細(xì)胞經(jīng)放線菌酮處理后，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)CARLo-5可降低PTBP1降解程度（P<0.05）。
　　6.Western blot法分析結(jié)果顯示，KYSE30和KYSE180細(xì)胞經(jīng)MG132聯(lián)合放線菌酮處理后，與對(duì)照組相比，PTBP1蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異。
　　7.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

13、敲低 PTBP1基因可促進(jìn) KYSE30和KYSE180細(xì)胞 PKM2蛋白水平降低， Mcl-1、PKM1蛋白水平升高（P<0.05）。
　　8.Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低和過(guò)表達(dá)CARLo-5后KYSE30和KYSE180細(xì)胞中miR-218-5p表達(dá)水平分別增高和降低（P<0.05）。
　　9.MTS法檢測(cè)結(jié)果顯示，敲低 miR-218-5p可促進(jìn) KYSE30和KYSE180細(xì)胞增殖活性（P<0.05）

14、；而過(guò)表達(dá)miR-218-5p對(duì)KYSE30和KYSE180細(xì)胞增殖具有抑制作用（P<0.05）。Transwell和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低miR-218-5p表達(dá)能促進(jìn)KYSE30和KYSE180細(xì)胞遷移和侵襲能力，過(guò)表達(dá)miR-218-5p能抑制KYSE30和KYSE180細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。
　　10.MTS法檢測(cè)結(jié)果顯示，敲低 miR-218-5p表達(dá)能夠部分降低CARLo-5過(guò)表達(dá)對(duì)KYSE30和K

15、YSE180細(xì)胞增殖的增強(qiáng)作用（P<0.05）；Transwell遷移結(jié)果顯示，敲低 miR-218-5p表達(dá)能夠部分降低 CARLo-5過(guò)表達(dá)對(duì)KYSE30和KYSE180細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)作用（P<0.05）。
　　11.Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低 miR-218-5p和過(guò)表達(dá)miR-218-5p后KYSE30和KYSE180細(xì)胞中ROBO1、BMI1、RELN蛋白表達(dá)水平分別增高和降低（P<0.05）。

16、>　　12.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在 KYSE30和KYSE180細(xì)胞中敲低miR-218-5p和過(guò)表達(dá)miR-218-5p后可顯著影響ROBO1蛋白表達(dá)水平分別增高和降低（P<0.05），BMI1和RELN蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變。
　　第三部分：CARLo-5對(duì)食管癌細(xì)胞裸鼠種植瘤的影響
　　目的：研究CARLo-5在體內(nèi)對(duì)食管癌增殖的影響。
　　方法：
　　1.構(gòu)建穩(wěn)定敲低CARLo-5的食管

17、癌細(xì)胞，進(jìn)行裸鼠皮下種植瘤實(shí)驗(yàn)，并觀察種植瘤的生長(zhǎng)情況。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠種植瘤組織中PTBP1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，sh-CARLo-5組裸鼠皮下種植瘤增長(zhǎng)速度顯著下降（P<0.05）。
　　2.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，敲低 CARLo-5組的裸鼠種植瘤組織中PTBP1的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　食管癌組織和細(xì)胞中CARLo-5的表達(dá)水平上調(diào)