阿折地平復(fù)合物的制備及與人血清白蛋白的相互作用研究.pdf

1、藥物-小分子復(fù)合物，包括共晶和共無定形，是藥物活性成分（active pharmaceutical ingredient，API）和共晶前體（co-crystal former，CCF）及共無定形前體（co-amorphous former，CAF）以氫鍵的形式進(jìn)行超分子組裝而成的新固態(tài)形式，是改善API理化性質(zhì)的新技術(shù)和新思維。阿折地平是新型二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，與同類藥物相比，在治療中度和重度高血壓的同時(shí)，具有利尿、心臟保護(hù)性、腎

2、保護(hù)性、抗動(dòng)脈硬化等優(yōu)勢(shì)。阿折地平有兩個(gè)同質(zhì)異晶體：晶型α和β，兩種晶型的水溶性都很低。這兩種晶型的分子排布和空間堆積方式不同從而有著不同的理化性質(zhì)，如α-晶型的溶解度較β-晶型高，但α-晶型為亞穩(wěn)態(tài)晶型，在合適的條件下可轉(zhuǎn)化成β-晶型。研究表明藥物-小分子前體復(fù)合物的形成可以有效地改善難溶性藥物的溶解度、溶出速率、穩(wěn)定性，從而改善藥物的生物利用度。
　　目的：本文的目的之一是以阿折地平的兩個(gè)晶型為模型API，篩選能與之形成復(fù)合物

3、（包括共晶和共無定形）的前體分子，制備基于兩個(gè)晶型的復(fù)合物新的固態(tài)形式，并對(duì)其進(jìn)行固態(tài)表征和溶解度、溶出速率等理化性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，分析復(fù)合物超分子中兩組分的相互作用力的類型；探索不同晶型對(duì)復(fù)合物的形成和理化性質(zhì)的影響；本文的目的之二是通過模擬人體的生理環(huán)境，研究篩選出來的各復(fù)合物與人血清白蛋白（HSA）相互作用，從而從分子水平上探索API-小分子超分子復(fù)合物形成后，API與HSA的作用方式和規(guī)律發(fā)生何種變化。
　　方法：以阿折地平兩

4、個(gè)晶型為API模型，以草酸和哌嗪兩個(gè)生物相容性的小分子為CCF或CAF分子，采用溶劑（乙醇）輔助濕研磨法（solvent assisted grinding，SG）和干粉末研磨法（neat powder grinding，NG）進(jìn)行復(fù)合物的篩選。此外，采用熒光光譜法和紫外可見光譜法對(duì)復(fù)合物與HSA的相互作用進(jìn)行研究。
　　1.復(fù)合物表征：制備API/CCF（CAF）摩爾比分別為2:1、1:1和1:2的阿折地平（α或β）-草酸復(fù)合物

5、和阿折地平-哌嗪復(fù)合物樣品；采用X-射線粉末衍射法（PXRD）、差示掃描量熱法（DSC）、熱重分析法（TG）、溫度調(diào)制差示掃描量熱法（TMDSC）、冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡法（SEM）、傅里葉紅外光譜法（FT-IR）和固態(tài)核磁共振光譜（ssNMR）技術(shù)對(duì)阿折地平-草酸復(fù)合物和阿折地平-哌嗪復(fù)合物進(jìn)行確證和初步研究。
　　2.復(fù)合物理化性質(zhì)評(píng)價(jià)：采用搖瓶法測(cè)定α-阿折地平、β-阿折地平原料藥及各自阿折地平-草酸復(fù)合物和阿折地平-哌嗪復(fù)

6、合物在0.1 mol/L鹽酸溶液和0.01 mol/L鹽酸溶液2種介質(zhì)中的平衡溶解度；采用槳法測(cè)定α-阿折地平、β-阿折地平原料藥及各自阿折地平-草酸復(fù)合物和阿折地平-哌嗪復(fù)合物在0.1 mol/L的鹽酸溶液中的溶出速率；根據(jù)藥典記載的引濕性測(cè)定法在25±1 ℃、相對(duì)濕度75％±1%條件下測(cè)定了α-阿折地平、β-阿折地平原料藥及各自阿折地平-草酸復(fù)合物和阿折地平-哌嗪復(fù)合物的引濕性。通過對(duì)阿折地平復(fù)合物溶解度、溶出速率及吸濕性等相關(guān)理化

7、性質(zhì)的測(cè)定，探索不同晶型對(duì)復(fù)合物的形成和理化性質(zhì)的影響。
　　3.在生理?xiàng)l件下，利用熒光光譜和紫外-可見光譜分別研究α-阿折地平、α-阿折地平-草酸1:1（NG）復(fù)合物、α-阿折地平-哌嗪1:1（NG）復(fù)合物和阿折地平-哌嗪1:2（NG）復(fù)合物與HSA的相互作用。確定熒光猝滅機(jī)制、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，并通過公式計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)，討論了結(jié)合力類型。使用同步熒光光譜研究α-阿折地平、α-阿折地平-草酸1:1（NG）復(fù)合物、α-阿折地平

8、-哌嗪1:1（NG）復(fù)合物和阿折地平-哌嗪1:2（NG）復(fù)合物對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。通過此研究探明不同CCF（CAF）和同一CCF（CAF）、不同的摩爾比對(duì)API與HSA的作用規(guī)律的影響。
　　結(jié)果：
　　1.α-阿折地平和β-阿折地平與草酸以不同方法（SG和NG）、不同比例（2:1，1:1和1:2）篩選出12個(gè)復(fù)合物，經(jīng)PXRD表征驗(yàn)證，α-阿折地平-草酸2:1（SG）和β-阿折地平-草酸2:1（SG）2個(gè)樣品的PXRD

9、出現(xiàn)新的衍射峰，初步判斷形成了共晶；α-阿折地平-草酸2:1（NG）、α-阿折地平-草酸1:1（SG和NG）、α-阿折地平-草酸1:2（SG和NG）、β-阿折地平-草酸2:1（NG）、β-阿折地平-草酸1:1（SG和NG）、β-阿折地平-草酸1:2（SG和NG）10個(gè)樣品的PXRD圖顯示為無特征衍射峰的衍射暈，初步判斷為共無定形。經(jīng)DSC和TG分析，2個(gè)共晶樣品的熔點(diǎn)均為130.4 ℃；經(jīng)TMDSC測(cè)定β-阿折地平-草酸2:1（NG），

10、1:1（SG），1:1（NG），1:2（SG），1:2（NG）和α-阿折地平-草酸2:1（NG），1:1（SG），1:1（NG），1:2（SG），1:2（NG）10個(gè)共無定形樣品的Tg分別為112.6 ℃、134.1 ℃、134.4 ℃、76.3 ℃、110.4 ℃、112.5 ℃、134.7 ℃、134.8 ℃、77.3 ℃和110.8 ℃；SEM顯微圖片進(jìn)一步顯示出兩個(gè)共晶樣品與α-阿折地平和β-阿折地平一樣，均呈現(xiàn)出或塊狀或片狀的

11、晶態(tài)本質(zhì)，而共無定形樣品均呈現(xiàn)出沒有固定形狀的球形顆粒；FT-IR和ssNMR圖譜的結(jié)果表明：阿折地平與草酸之間存在N-H···O和O-H···O氫鍵；溶解度測(cè)定結(jié)果表明，所有樣品在0.1 mol/L鹽酸介質(zhì)中的溶解度均比0.01 mol/L鹽酸中大，在0.1 mol/L鹽酸溶液中α-阿折地平和β-阿折地平的溶解度分別為268.40±3.2μg/mL和222.46±2.8μg/mL；在篩選出來的12個(gè)復(fù)合物中溶解度最大的分別為α-阿折地

12、平-草酸1:2（NG）為541.35±5.2μg/mL和β-阿折地平-草酸1:2（NG）為495.05±6.0μg/mL；在0.1 mol/L鹽酸介質(zhì)中的溶出試驗(yàn)中，α-阿折地平和β-阿折地平的t50分別為292.61 min和803.44 min，12個(gè)復(fù)合物樣品中t50最小的分別為α-阿折地平-草酸1:2（NG）為55.59 min和β-阿折地平-草酸1:2（NG）為53.89 min。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示α-阿折地平-草酸1:2（NG）和

13、β-阿折地平-草酸1:2（NG）與各自的原料藥阿折地平單體相比有顯著性差異（P＜0.05）。
　　2.雖然阿折地平的兩種晶型均可以和草酸形成共無定形復(fù)合物，但是α-阿折地平-草酸復(fù)合物與β-阿折地平-草酸復(fù)合物的形成過程明顯不同。PXRD顯示共無定形復(fù)合物形成過程中，當(dāng)α-阿折地平與草酸共研磨時(shí)，需要20 min就可以完全形成新的復(fù)合物；當(dāng)β-阿折地平與草酸共時(shí)，直至研磨時(shí)間延長(zhǎng)至60 min時(shí)，PXRD譜圖中才出現(xiàn)象征共無定形的

14、衍射暈。FT-IR光譜中，當(dāng)β-阿折地平和草酸以2:1和1:1的比例制備樣品時(shí)，其酯羰基的伸縮振動(dòng)向低波數(shù)移動(dòng)了16 cm-1，這是因?yàn)棣?阿折地平同質(zhì)二聚體中的一個(gè)氫鍵轉(zhuǎn)換為異質(zhì)二聚體共無定形復(fù)合物中的另一個(gè)氫鍵。而當(dāng)β-阿折地平/草酸的比例為1:2時(shí)，IR譜圖在1750 cm-1處出現(xiàn)了自由的酯羰基的伸縮振動(dòng)吸收，這表明更多的草酸分子的介入，破壞了β-阿折地平的晶體，使酯羰基游離了出來。然而，對(duì)于α-阿折地平復(fù)合物體系，即使是在草酸

15、含量較低的比例的復(fù)合物中，IR譜圖在1750 cm-1處就可以觀察到自由的酯羰基的吸收，說明α-阿折地平的晶體結(jié)構(gòu)更容易被外界引入的分子破壞，更容易形成新的超分子體系。
　　3.α-阿折地平和β-阿折地平與哌嗪以不同方法（SG和NG）、不同比例（2:1，1:1和1:2）制備的12個(gè)復(fù)合物經(jīng)PXRD初步表征為α-阿折地平-哌嗪1:2（SG）和α-阿折地平-哌嗪1:1（SG）2個(gè)樣品出現(xiàn)新的衍射峰，即共晶的形成；α-阿折地平-哌嗪1:

16、2（NG）、α-阿折地平-哌嗪1:1（NG）、α-阿折地平-哌嗪2:1（NG）3個(gè)樣品出現(xiàn)無特征衍射峰的衍射暈，即共無定形形成。而α-阿折地平-哌嗪2:1（SG）樣品及β-阿折地平與哌嗪制備的6個(gè)樣品的PXRD圖均與β-阿折地平基本一致，未形成新的復(fù)合物；經(jīng)DSC和TG分析2個(gè)共晶樣品的熔點(diǎn)均為163.2 ℃，但是α-阿折地平-哌嗪1:1（SG）共晶中在192.6 ℃還出現(xiàn)一個(gè)吸熱峰，經(jīng)推測(cè)應(yīng)為富余的α-阿折地平在乙醇研磨中轉(zhuǎn)化為β-阿

17、折地平；經(jīng)TMDSC測(cè)定3個(gè)共無定形樣品α-阿折地平-哌嗪1:2（NG），1:1（NG）和2:1（NG）的Tg分別為74.6 ℃，66.8 ℃和77.9 ℃；SEM顯微圖片進(jìn)一步顯示出共晶樣品與α-阿折地平一樣，均呈現(xiàn)出塊狀的晶態(tài)本質(zhì)，而共無定形樣品均為球形顆粒；FT-IR和ssNMR圖譜可以推測(cè)阿折地平與哌嗪形成復(fù)合物中存在 N-H···O和O-H···O氫鍵。在0.1 mol/L和0.01 mol/L鹽酸介質(zhì)中，α-阿折地平的溶解度

18、為268.40±3.2μg/mL和104.85±1.0μg/mL；在0.1 mol/L鹽酸介質(zhì)中，α-阿折地平-哌嗪1:2（SG）溶解度最大為552.81±2.2μg/mL，在0.01 mol/L鹽酸介質(zhì)中，α-阿折地平-哌嗪2:1（NG）溶解度最大為108.37±5.6μg/mL；在0.1 mol/L鹽酸介質(zhì)中的溶出試驗(yàn)中，α-阿折地平的t50為292.61 min，樣品中t50最小的為α-阿折地平-哌嗪1:2（NG）為38.70 m

19、in。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示α-阿折地平-哌嗪1:2（NG）與原料藥α-阿折地平單體相比有顯著性差異（P＜0.05）。
　　4在291、298和310 K溫度下，熒光光譜圖顯示α-阿折地平、α-阿折地平-哌嗪1:2（NG）、α-阿折地平-哌嗪1:1（NG）復(fù)合物和α-阿折地平-草酸1:1（NG）復(fù)合物對(duì)HSA均有猝滅作用。紫外光譜初步顯示四種樣品與HSA相互作用的猝滅機(jī)制均為靜態(tài)猝滅。同步熒光光譜中，當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，四個(gè)樣品加入后最大

20、發(fā)射波長(zhǎng)沒發(fā)生明顯的位移，當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，四個(gè)樣品加入后最大發(fā)射波長(zhǎng)均有輕微的紅移（從283 nm移動(dòng)至287 nm）。在291、298和310 K溫度下，α-阿折地平與HSA相互作用的猝滅常數(shù)分別為1.767、1.729、1.584×104 L/M，α-阿折地平-哌嗪1:2（NG）復(fù)合物的猝滅常數(shù)分別為1.858、1.757、1.528×104 L/M，α-阿折地平-哌嗪1:1（NG）復(fù)合物的猝滅常數(shù)分別為1.753、1.681

21、、1.606×104 L/M，α-阿折地平-草酸1:1（NG）復(fù)合物的猝滅常數(shù)分別為4.590、4.557、4.148×104 L/M；α-阿折地平與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)分別為0.839、0.977、1.862×103 M-1，α-阿折地平-哌嗪1:2（NG）復(fù)合物結(jié)合常數(shù)分別為0.754、0.786、1.099×103 M-1，α-阿折地平-哌嗪1:1（NG）復(fù)合物結(jié)合常數(shù)分別為0.566、2.110、3.134×103 M-1，

22、α-阿折地平-草酸1:1（NG）復(fù)合物結(jié)合常數(shù)分別為9.168、8.568、5.800×103 M-1。
　　結(jié)論：
　　1.PXRD圖中樣品的新峰、DSC和TG分析中新熔點(diǎn)的出現(xiàn)、SEM顯微圖中或塊狀或片狀的形態(tài)特點(diǎn)均表明阿折地平與草酸和哌嗪形成了新的晶態(tài)復(fù)合物即共晶；PXRD圖中樣品的典型衍射暈、TMDSC分析中出現(xiàn)玻璃轉(zhuǎn)化溫度、SEM顯微圖中或大或小的球狀顆粒均表明阿折地平與草酸和哌嗪形成了新的無定形復(fù)合物即共無定形。

23、由FT-IR譜圖推測(cè)阿折地平-草酸復(fù)合物以草酸的C=O基團(tuán)與阿折地平的N-H基團(tuán)和阿折地平的C=O基團(tuán)與草酸的O-H基團(tuán)形成的氫鍵相互作用而成；阿折地平-哌嗪復(fù)合物以阿折地平的C=O基團(tuán)與哌嗪的N-H基團(tuán)形成的氫鍵相互作用而成。不同晶型與載體形成的復(fù)合物之間的差異可以根據(jù)FT-IR和ssNMR譜圖中峰位的不同來進(jìn)一步確證。
　　2.阿折地平復(fù)合物溶解度和溶出速率的測(cè)定結(jié)果表明，共晶和共無定形的形成可以顯著改善阿折地平原料藥的理化性

24、質(zhì)，是改善難溶性藥物的有效方法之一，也為提高藥物在體內(nèi)的生物利用度提供可行性。
　　3.PXRD說明α晶型比熱力學(xué)穩(wěn)定晶型β更容易與草酸形成新的復(fù)合物；FT-IR譜結(jié)果說明復(fù)合物形成過程中α-阿折地平共無定形系統(tǒng)與β-阿折地平共無定形系統(tǒng)的分子間作用力不同。
　　4.α-阿折地平、α-阿折地平-哌嗪1:2（NG）復(fù)合物、α-阿折地平-哌嗪1:1（NG）復(fù)合物和α-阿折地平-草酸1:1（NG）復(fù)合物對(duì)HSA的相互作用的研究結(jié)果

25、表明，復(fù)合物的形成引起了猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)的改變，尤其是α-阿折地平-草酸1:1（NG）復(fù)合物對(duì)HSA的作用與α-阿折地平相比有很大改變；與此同時(shí)，同一載體不同比例制備的復(fù)合物、同一比例不同載體制備的復(fù)合物與HSA相互作用的猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)也不同。不同溫度下四個(gè)樣品與HSA的相互作用的結(jié)合常數(shù)較大，說明與HSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可以被HSA所儲(chǔ)存和運(yùn)輸。結(jié)合常數(shù)的差異表明不同藥物與HSA的結(jié)合功能不同。當(dāng)溫度升高時(shí)，α-阿折地平-