金屬配合物的合成及其與人血清白蛋白相互作用的抗腫瘤活性的研究.pdf

1、本文合成了兩類金屬配合物。第一類金屬配合物是以希夫堿縮氨基硫脲為配體的銅金屬配合物。第二類金屬配合物是以白花丹素為配體，合成了兩個還沒有見報道的銅金屬配合物。我們利用元素分析、紅外光譜、質譜以及單晶x-射線衍射分析等技術對這些金屬配合物的結構進行表征鑒定。在細胞水平上，利用MTT法、流式細胞儀檢測法和熒光拍照等手段對這些金屬配合物進行體外抗腫瘤活性的檢測，以及其誘導腫瘤細胞凋亡機制的研究。在分子水平上，利用蛋白免疫印記技術(Wester

2、n Blot)檢測這些金屬配合物對凋亡相關蛋白以及周期相關蛋白表達情況的影響。本論文研究內容主要為以下幾點:
　　1.簡要介紹腫瘤現(xiàn)狀和抗癌藥物的一些概況;概述了希夫堿縮氨基硫脲及其金屬配合物的生物活性的研究進展;對人血清白蛋白(HSA)作為藥物載體靶向治療腫瘤的研究做了簡單的介紹，并在此基礎上簡要的闡述了本論文的選題依據(jù)以及意義。
　　2.銅(Ⅱ)配合物被認為是作為下一代金屬抗癌藥物的一個很有前景的候選藥物，并被廣泛研究。

3、因此，本章合成了四個由希夫堿縮氨基硫脲(L1-L4)為配體的雙核銅(Ⅱ)配合物，即[CuCl(L1)]2(C1)，[CuNO3(L2)]2(C2)，[Cu(NCS)(L3)]2(C3)和[Cu(CH3COO)(L4)]2(C4)。用x-射線晶體衍射分析解析這四種配合物的晶體結構。通過MTT法、熒光顯微鏡觀察拍照法、流式細胞儀檢測法以及Western Blot研究了C1-C4配合物和C4-HSA復合物的抗腫瘤活性和作用機制。研究結果如下:

4、(1)MTT法檢測到Cu(Ⅱ)離子和配體(HL)對BEL-7404、A549、NCI-H460這幾種癌細胞的作用效果并不好，但是C1-C4配合物對癌細胞具有較高的細胞毒性。比較配合物C1-C4，發(fā)現(xiàn)C4配合物的細胞毒性最強，而C1配合物的細胞毒性最弱。C4配合物是C2和C3配合物的兩倍，而C2和C3配合物又是C1配合物毒性的兩倍。C4配合物對上述三種癌細胞的IC50依次為0.486±0.010、0.507±0.021、0.235±0.0

5、10μM，當然，一旦它們與人血清白蛋白相互作用后，對腫瘤細胞的毒性會提高，相應的IC50會降低。(2)以人肝癌細胞BEL-7404為代表，我們研究了C1-C4配合物和C4-HSA復合物對腫瘤細胞的作用機制。本章利用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)熒光染色法和FITC AnnexinⅤ/PI雙染檢測法，表明上述配合物可以誘導細胞發(fā)生凋亡。利用JC-1染色實驗、活性氧(ROS)檢測實驗、GSH/GSSG檢測實驗對C1-C4配合物以及C4-HS

6、A復合物誘導BEL-7404細胞凋亡機制進行了研究。JC-1染色結果表明，上述幾種物質刺激BEL-7404細胞后，用JC-1染色，發(fā)現(xiàn)細胞逐漸由發(fā)紅色熒光轉變?yōu)榘l(fā)綠色熒光，表明線粒體膜電位降低，說明癌細胞發(fā)生了凋亡。ROS和GSH/GSSG實驗結果表明，相對于空白對照組而言，這幾種物質使得細胞內ROS的水平提高了，GSH/GSSG的比值降低了，其中C1-C4這四種配合物中，C4配合物ROS水平最高，GSH/GSSG的比值最低，而C1配合

7、物ROS水平提高得最小、GSH/GSSG的比值最大，這可能與這四種配合物上所帶的官能團有關。(3)采用Western Blot檢測了C1-C4配合物以及C4與HSA相互作用后對BEL-7404細胞中的Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白以及caspase-9、caspase-3蛋白表達的影響，實驗結果顯示:抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達下調了，而促凋亡蛋白Bax的表達上調，導致Bax/Bcl-2的比值變大了，促使腫瘤細胞更

8、容易發(fā)生凋亡。此外，細胞色素C(Cyt-c)的釋放促進了caspase家族蛋白的級聯(lián)反應。上述實驗結果證明了C1-C4配合物以及C4配合物和HSA相互作用后對細胞的抗腫瘤活性的機制是通過內源性線粒體介導的凋亡途徑。
　　3.以天然白花丹素為配體(PLN)合成了四個銅(Ⅱ)金屬配合物，它們依次為[Cu(PLN)2]·2H2O(C1);[Cu(PLN)(bipy)(H2O)]NO3·2H2O(C2);[Cu(PLN)(Phen)]NO

9、3·0.25H2O(C3);[Cu(PLN)(Phen)(Br)]CH3OH(C4)。采用元素分析、紅外光譜、質譜以及單晶x-射線衍射分析等技術對這些銅金屬配合物的結構進行表征鑒定，發(fā)現(xiàn)這四種銅金屬配合物(C1、C2、C3、C4)都是單核配合物。這些銅(Ⅱ)金屬配合物結構的確定為后續(xù)的金屬基藥物抗腫瘤生物活性和作用機制的研究提供了物質基礎和保障。葉酸(FA)修飾的HSA載體(FA-HSA)有望改善抗腫瘤藥物的靶向性與藥效。為了開發(fā)金屬抗

10、腫瘤藥物的FA-HSA載體，我們研究了FA-HSA作為由天然白花丹素為配體衍生的銅(Ⅱ)金屬配合物的載體的抗腫瘤活性和機制。熒光光譜和分子對接表明，Cu(Ⅱ)金屬配合物結合到HSA的ⅡA亞結構域上。利用MTT法研究了這四個銅金屬配合物在有無FA-HSA載體的條件下對人乳腺癌細胞(MCF-7)和人宮頸癌細胞(HeLa)這兩種腫瘤細胞以及正常細胞的細胞毒性，結果表明，與單獨的銅(Ⅱ)金屬配合物作用于腫瘤細胞相比，在某種程度上，通過選擇性的在

11、腫瘤細胞中積累葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復合物，從而增強該復合物對葉酸陽性的腫瘤細胞的細胞毒性，但是沒有提高對在體外的正常細胞(WI-38)的細胞毒性;利用流式細胞儀檢測法，檢測裸藥C3和該裸藥與載體的復合物，即葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復合物對HeLa周期的影響，結果顯示，葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復合物對HeLa的G2/M期的細胞周期阻滯能力更強，并下調細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)和細胞周期蛋白B1的表達水平。此外，葉