嗜熱內(nèi)切木聚糖酶DtX及其C端截短突變體酶學(xué)性質(zhì)的表征.pdf

1、內(nèi)切木聚糖酶是木聚糖降解酶系的重要組成部分,可有效水解木聚糖的β-1,4糖苷鍵,在造紙、食品、能源、飼料及環(huán)境等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用。特別是來(lái)源于嗜熱微生物的嗜熱木聚糖酶,具有高溫催化活性、獨(dú)特的熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)引起國(guó)際學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注。嗜熱微生物Dictyoglomus turgidumDSM6724分離自俄羅斯堪察加半島的烏宗火山,最適生長(zhǎng)溫度達(dá)75oC,其基因組中含有一個(gè)潛在的GH11家族β-1,4內(nèi)切木聚糖酶基因,

2、其與Dictyoglomusthermophilum Rt46b.1的木聚糖酶XynB和Caldicellulosiruptor sp. Rt69 B.1內(nèi)切木聚糖酶序列一致性分別為81.8％和69%,與其它木聚糖酶的相似性均在60%以下。我們預(yù)測(cè)該基因編碼的木聚糖酶可能具良好的熱穩(wěn)定性,希望通過(guò)對(duì)其進(jìn)行研究,發(fā)掘性質(zhì)優(yōu)良的新型木聚糖酶基因,并對(duì)其催化和熱穩(wěn)定性機(jī)制進(jìn)行深入探討。
　　本研究成功地克隆了Dictyoglomus t

3、urgidum DSM6724中的β-1,4內(nèi)切木聚糖酶基因(Dtur_0243),并在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)。經(jīng)過(guò)菌體破碎、熱處理和Ni-NTA親和層析,獲得了純化的重組蛋白DtX,其純化倍數(shù)為2.68倍,蛋白收率73.6%,純蛋白產(chǎn)量達(dá)830mg/L。酶學(xué)性質(zhì)表征顯示,DtX可高效水解多種木聚糖底物,對(duì)山毛櫸木聚糖底物的比活達(dá)825.4U。DtX具有良好的熱穩(wěn)定性和p H穩(wěn)定性,最適反應(yīng)溫度為80oC,在85oC下的半衰期為300

4、min,在80oC保溫10小時(shí)活性基本完全保持;最適pH為6.5,在pH4-10之間能維持60%以上的活力。
　　對(duì)Dt X的氨基酸序列進(jìn)行分析顯示,該酶含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,由催化結(jié)構(gòu)域(Catalytic Domain, CD)和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Carbohydrate Binding Module, CBM)組成,中間通過(guò)一段由14個(gè)氨基酸組成的連接肽(Linker)連接。為研究該酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系,我們

5、構(gòu)建了Dt X的兩種截短變體,分別是刪除了C末端CBM結(jié)構(gòu)域的DtX-CDL,以及刪除了CBM結(jié)構(gòu)域和Linker的Dt X-C D。兩種截短突變體均以胞內(nèi)可溶形式表達(dá),且熱穩(wěn)定性及活性都比野生型發(fā)生了顯著變化。在最適條件下,DtX-CDL及DtX-CD的比活性分別比野生型提高了42.8%和17.92%,達(dá)到1441.8U和973.3U;90oC時(shí)DtX-CDL半衰期為1400分鐘,是野生型的55倍,而DtX-CD在同樣溫度的半衰期僅有

6、10分鐘,比野生型降低了60%,這顯示了CBM與Linker對(duì)酶性質(zhì)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。在此基礎(chǔ)上,我們通過(guò)對(duì)Dt X及其突變體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)建模,發(fā)現(xiàn)Dt X-C D的催化結(jié)構(gòu)域C末端最后一個(gè)β-片層與野生型相比明顯縮短。這使其缺失了穩(wěn)定酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)氫鍵網(wǎng)絡(luò),可能是造成其穩(wěn)定性下降的主要原因。因此,在該區(qū)域引入額外的二硫鍵、鹽橋等穩(wěn)定作用,有可能進(jìn)一步提高DtX的熱穩(wěn)定性。本論文克隆了Dictyoglomus turgidum DSM67