GDSL家族嗜熱酯酶EstL5的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、酯酶是一類可催化酯類水解生成相應(yīng)酸和醇，或催化酸和醇縮合生成酯類的酶，它們在生命過程中發(fā)揮著重要的作用，同時在工業(yè)生產(chǎn)中擁有良好的應(yīng)用前景。
　　本研究首次報道一個來源于Geobacillus thermodenitrificans T2的中度嗜熱酯酶，EstL5，它是GDSL家族酯酶的新成員，更進(jìn)一步的序列分析可將之歸入SGNH亞家族。經(jīng)過克隆、表達(dá)、純化，我們獲得了融合6His標(biāo)簽的重組EstL5蛋白。酶活檢測發(fā)現(xiàn)，它的最適底

2、物是短碳鏈羧酸酯類，對丁酸對硝基苯酯表現(xiàn)出最高的活性，對短鏈的甘油三酯類底物有較弱活性，同時對所有長鏈酯類不具任何活性。因此將EstL5定義為酯酶(esterase)而非脂酶(lipase)。另外沒有檢測到EstL5有硫酯酶或是磷脂酶的活性。理化性質(zhì)測定結(jié)果顯示，EstL5的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH值為8.0;在0℃條件下仍有24％的酶活力;且在55℃保存12小時后保留100％的活性。EstL5可在多種有機(jī)溶劑和化合物環(huán)境中保

3、持穩(wěn)定。這些理化性質(zhì)表明該酯酶具有較好的穩(wěn)定性和寬泛的反應(yīng)溫度，為該酶的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
　　表達(dá)純化了硒代EstL5，通過氣相懸滴擴(kuò)散法獲得了晶體。收集了分辨率為3.0(A)的衍射數(shù)據(jù)，晶體的空間群為P43212，單個晶胞參數(shù)為a=b=101.48(A)，c=124.56(A)。通過單波長反常散射法確定了相位，并完成了硒代EstL5的結(jié)構(gòu)解析。獲得分辨率為2.79(A)的野生型EstL5的晶體，并以硒代晶體結(jié)構(gòu)為模板通過分子

4、取代法完成結(jié)構(gòu)解析。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)野生型EstL5與硒代EstL5的晶體結(jié)構(gòu)幾乎沒有差別。EstL5的結(jié)構(gòu)顯示在其中心區(qū)域擁有5個平行的β折疊片，它們的兩側(cè)分別覆蓋有α螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)特征與SGNH家族酯酶的典型結(jié)構(gòu)特征相吻合。
　　序列分析和結(jié)構(gòu)信息顯示，EstL5的催化三聯(lián)體由Ser63、Asp235和His238組成，其中負(fù)責(zé)親核攻擊的Ser63位于一個β折疊和一個α螺旋的連接處，而Asp235、His238位于靠近C末端的兩個螺

5、旋間的柔性環(huán)上，它們的空間位置非常接近。EstL5的“氧孔”結(jié)構(gòu)由Ser63、Gly101、Asn133組成，它們互相之間的距離約在3.5(A)至6(A)范圍內(nèi)，屬于松散型“氧孔”。單突變結(jié)果顯示催化三聯(lián)體和“氧孔”結(jié)構(gòu)中任何一個氨基酸殘基的突變都會極大地影響EstL5的活性?？赏贫ù呋?lián)體Ser-Asp-His對EstL5的酯酶活性起到關(guān)鍵作用，并且“氧孔”理論可用于解釋其催化機(jī)制，“氧孔”形成的適宜的靜電環(huán)境對催化過程起著重要作用