利用FRET技術檢測緩激肽受體和Apelin受體二聚化的實驗研究.pdf

1、緩激肽Ⅰ型受體(B1 bradykinin receptor, BDKRB1/B1R)和Apelin受體(putative receptor protein related to AT1,APJ)都是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)超家族成員,它們在心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。二者能否形成異源二聚體發(fā)揮生理作用尚未見報道。本課題試圖探討B(tài)1R和APJ能否形成異源二聚

2、體,研究該異源二聚體對細胞內信號傳導功能的影響,為B1R和APJ參與的相關生理功能的細胞內分子機制提供實驗依據(jù),為探討相關疾病發(fā)生的分子機制提供資料。本研究有助于探尋相關疾病治療的新突破點。
　　本實驗通過構建含人B1R和APJ的重組表達載體,將重組載體轉染到人胚胎腎(human embryonic kidney, HEK293)細胞后,使用激光共聚焦顯微鏡技術和Western blot技術驗證B1R和APJ受體的表達,然后使用激

3、光共聚焦顯微鏡技術和熒光共振能量轉移技術(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)驗證B1R和APJ之間能否形成異源二聚體,并且初步研究了B1R和APJ形成異源二聚體對信號傳導的影響。
　　本研究采用分子克隆方法,首先PCR技術擴增目的片段,然后限制性內切酶酶切擴增片段和載體,酶切后T4 DNA連接酶連接成重組質粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3

4、.1,并經(jīng)測序驗證。重組質粒轉染HEK293細胞,用Western blot和激光共聚焦鑒定重組質粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1在HEK293細胞中的表達及定位。
　　在驗證受體表達及定位正確的基礎上,使用激光共聚焦顯微技術驗證重組質粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1的共定位,結果顯示B1R和APJ都在細胞膜上表達,二者定位高度一致,初步認為B

5、1R和APJ可能會發(fā)生相互作用。
　　利用上述質粒轉染HEK293細胞,24小時后,利用FRET技術檢測APJ和B1R之間FRET信號的強度。結果顯示實驗組FRET強度明顯高于對照組,證實B1R和APJ之間發(fā)生了異源二聚化。
　　實驗結果證實B1R和APJ在HEK293細胞中發(fā)生了二聚化作用,據(jù)此推測B1R和APJ的結合可能會改變胞內信號傳導途徑,于是本實驗對細胞的增殖以及胞內Ca2+進行了研究。
　　細胞增殖的檢測:

6、重組質粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1單獨轉染或者共同轉染HEK293細胞,使用CCK8試劑分別處理1小時和24小時后,使用酶標儀檢測細胞數(shù)目。結果表明細胞增殖的比率明顯升高,說明APJ和B1R發(fā)生二聚化后,促進細胞的增殖。
　　Ca2+的檢測:重組質粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1單獨轉染或者共同轉染HEK293細胞,使用BRET技術檢測Ca

7、2+熒光值。結果發(fā)現(xiàn)APJ和B1R發(fā)生二聚化后有明顯的Ca2+增加,提示受體的二聚化可能會促進胞內Ca2+水平的增加。
　　本研究首次證實在轉染APJ和B1R的細胞內信號傳導過程中,APJ和B1R能形成異源二聚體,而且異源二聚體的形成會促進細胞的增殖,促進細胞內Ca2+增加。本實驗對于理解APJ和B1R參與的相關生理功能的細胞內分子機制提供了新的實驗依據(jù),為新型藥物的開發(fā)提供了新的可能的作用靶點,具有重要理論意義和實際推廣應用價值