靶向異二聚體型核受體的藥物發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、發(fā)現(xiàn)和確證新的藥物作用靶點是藥學研究的重要內容。核受體是一類配體依賴性激活的轉錄因子超家族，其在生長發(fā)育、新陳代謝、細胞分化和凋亡、免疫應答等人體許多重要生理過程中發(fā)揮關鍵作用。其中，異二聚體型核受體(heterodimernuclear receptors，HD-NRs)為核受體超家族中的主要成員。 維甲酸受體(Retinoid A receptor)、肝X受體(Live X receptor，LXRs)、法尼醇X受體(fam

2、esoid X receptor,FXR)均屬于異二聚體型核受體亞家族，其參與調控體內的維甲類物質以及糖，脂質，膽固醇、膽酸代謝，在機體的代謝平衡中起關鍵的作用。它們與RXR形成二聚體后，通過與特異響應元件結合調節(jié)基因的轉錄。心腦血管疾病、2型糖尿病、肥胖、骨質疏松、皮膚病，炎癥、神經退行性疾病和癌癥等的發(fā)生均與其功能和調控異常有關。因此這類核受體可作為治療代謝紊亂性疾病的新靶點。 本論文研究的主要內容為將異二聚體型核受體作為藥

3、物新靶點，進行適當?shù)拇_證和評價，并利用新的藥物篩選技術，建立高通量藥物篩選平臺，篩選發(fā)現(xiàn)新的先導化合物。本論文主要從以下幾個方面開展研究： 一．維甲酸受體高內涵篩選體系的構建與應用作為經典的異二聚體型核受體，維甲酸受體經實驗證實與癌癥和皮肽病等多種疾病密切相關，其激動劑已成功用于這類疾病的防治。然而，傳統(tǒng)的維甲酸受體激動劑，如全反式維甲酸仍具有一定的毒副作用。尋找高效、低毒、特異的小分子維甲類藥物仍是目前研究的熱點。本論文成功建

4、立了一個穩(wěn)定、靈敏、重復性好的維甲酸受體激動劑高內涵篩選體系，并結合虛擬篩選，從20,000個化合物中篩選得到了活性化合物7672和7666，并對7672進行了進一步的活性評價。 二．基于細胞的HD-NR激動劑高通量篩選和評價體系的建立和應用哺乳動物細胞單雜交技術是近些年發(fā)展起來，主要應用于核受體功能及其配體生理活性篩選和評價的新技術。該機理利用了核受體的分子結構中共有的兩個主要結構域：配體結合結構域(LBD)和DNA結合結構域

5、(DBD)，以及酵母細胞轉錄因子GAL4具有核受體相似結構的特點。將核受體的配體結合結構域(LBD)與酵母細胞轉錄因子GAL4的DNA結合結構域(DBD)融合成嵌合蛋白表達質粒，再與含有GAL4特異的響應元件的報告質粒共轉染，通過測定報告基因的表達水平從而評價核受體配體的激動或拮抗活性。另外，因為哺乳動物細胞沒有酵母的GAL4，所以不存在內源性核受體的之間的相互干擾和交叉效應，這也是該技術用于篩選和評價配體活性的最大優(yōu)點。 為了

6、研究和開發(fā)新的預防和治療代謝紊亂性疾病的候選藥物，以及進行相關機理研究，建立了基于哺乳動物細胞單雜新技術的異二聚體型核受體LXRα和FXR的高通量激動劑的篩選及活性評價體系。 首先利用RT-PCR技術從肝組織的總RNA中擴增LXRα和FXR的配體結合域(LBD)基因片斷，并將其與酵母轉錄因子GAL4的DNA結合域連接構建融合表達載體pBIND-LXRR(α-LBD，pBlND-FXR-LBD：而采用的報告質粒pG5是由人工合成5

7、xGAL4的相應元件，插入報告基因上游構建而成。 通過優(yōu)化多種轉染條件，確定了最佳的共轉染條件。利用陽性藥對細胞水平的FXR，LXR激動劑篩選模型進行了驗證。陽性藥在各自的模型中都呈現(xiàn)良好的量效關系和很高的信噪比，而且用于評價模型穩(wěn)定性的參數(shù)z’因子均在0.5-0.7之間，從而證明了所建立的模型具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。 經過篩選，從植物來源的純化合物庫中篩選得到了4個活性化合物，為特異的LXR激動劑，其對FXR有弱的激

8、活作用。通過進一步的載體改構和細胞轉染，基于哺乳動物單雜交技術原理，對新的HCS篩選體系的建立進行了初步摸索。 三．化合物對核受體調控作用對體外高通量篩選方法的建立和應用本研究成功建立了基于熒光偏振的評價配體結合LXR或FXR，募集共激活子能力的評價方法，其基本原理為當核受體與配體結合后，核受體構象會發(fā)生改變，從而促進了受體與共激活子的結合。利用核受體LBD及共激活子的LXXLL基序結合并采用熒光偏振的方法來篩選核受體的配體，該

9、方法適用適用于所有代謝性異二聚體型核受體，包括RAR、CAR、VDR、PPAR、LXR和FXR等。 通過體外的FP體系評價，4個活性化合物不僅在細胞水平可激活LXR，還可以直接與LXR結合，并募集共激活子，為LXR的激動劑。 體外和細胞水平篩選平臺的建立不僅可以在藥物發(fā)現(xiàn)的早期確證核受體先導化合物，發(fā)現(xiàn)用于調控與代謝相關的基因而治療代謝性疾病的藥物，而且為受體生理機制的闡明提供了堅實的基礎。 四、肝X受體活性化合

10、物活性評價和抗動脈粥樣硬化(AS)藥理活性研究本論文首次發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇四聚體的LXR激動活性，并首次揭示了其通過LXR通路在抗動脈粥樣硬化中發(fā)揮作用的機制。 首先研究了化合物在HDL代謝和膽固醇逆向轉運中的作用，發(fā)現(xiàn)化合物通過上調LXR的靶基因，可抑制泡沫化細胞的形成和促進脂裝載的巨噬細胞中膽固醇的外排。 化合物還具有抗炎活性，其可降低炎性因子的表達并抑制單核細胞和內皮細胞的粘附。 化合物還可增加超氧化物歧化酶的