斑馬魚DNA聚合酶Delta四亞基和相關(guān)因子的制備鑒定及赤點(diǎn)石斑魚IκBα基因的克隆與功能分析.pdf

1、本研究論文的第一部分是斑馬魚的DNA聚合酶Delta（Polymerase Delta, polδ）四個亞基（Pold1，Pold2，Pold3，Pold4）基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建和真核表達(dá)以及斑馬魚PCNA基因的克隆、原核表達(dá)及其互作蛋白的鑒定等方面的初步探索。
　　經(jīng)典模式生物斑馬魚體內(nèi)87％的基因與人源基因相似，這意味著斑馬魚不僅可以用于研究魚類病原體感染途徑及致病機(jī)理，也可用于探究人類疾病的致病機(jī)理。真核細(xì)胞DNA polδ是

2、染色體DNA復(fù)制中主要的復(fù)制酶，也參與多種形式的DNA損傷修復(fù)過程。而細(xì)胞增殖抗原（Proliferating cell nuclear antigen, PCNA）作為引導(dǎo)DNA polδ至復(fù)制叉上發(fā)揮作用的重要輔助因子，在DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)等細(xì)胞活動中發(fā)揮重要的作用。近年來，polδ的大規(guī)模分離純化技術(shù)已經(jīng)有很大的進(jìn)步，其具體生理生化功能也有大量的研究報(bào)道，但斑馬魚DNA polδ的研究報(bào)道甚少。本研究將斑馬魚DNA pol

3、δ的一個或多個亞基基因與桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBDM進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，獲得不同亞基基因組合的重組質(zhì)粒。利用新型的MultiBac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了含有斑馬魚DNA polδ不同亞基組合的重組病毒。同時(shí)嘗試?yán)谜婧讼到y(tǒng)制備重組polδ酶蛋白復(fù)合物。Western Blot分析表明，斑馬魚DNA polδ各亞基在Sf-9細(xì)胞中均能成功表達(dá)；質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)各重組蛋白分別由Pold1、Pold2、Pold4所編碼。本研究還對斑馬魚PCNA

4、基因進(jìn)行了克隆和重組質(zhì)粒的構(gòu)建，并通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了重組PCNA蛋白。利用CNBr-activated SepharoseTM4B制備重組PCNA蛋白親和層析柱，結(jié)合親和層析及質(zhì)譜技術(shù)篩選鑒定斑馬魚PCNA的互作蛋白。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示PCNA互作蛋白主要參與DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控等細(xì)胞生理活動。本部分的研究為深入研究polδ在機(jī)體繁殖和胚胎發(fā)育的功能奠定了基礎(chǔ)，為后續(xù)開發(fā)斑馬魚polδ缺陷型相關(guān)疾病模型提供依據(jù)。

5、r>　　本論文的第二部分進(jìn)行了赤點(diǎn)石斑魚NF-κB因子抑制蛋白IκBα基因的分子克隆與功能分析。水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的惡化給我國魚類養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。石斑魚是重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，研究其自身免疫相關(guān)基因及其作用機(jī)制，有利于提高石斑魚的免疫力及抗病力而達(dá)到健康養(yǎng)殖的目的。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為聯(lián)系天然免疫系統(tǒng)和特異性免疫系統(tǒng)的紐帶，參與機(jī)體免疫和發(fā)育的多種生理活動。本研究通過5'-和3'-RACE技術(shù)克隆并鑒定了一個編碼赤點(diǎn)石斑魚NF-κ

6、B因子抑制蛋白IκBα基因（命名為EaIκBα）。為進(jìn)一步分析其表達(dá)模式及抗病毒能力，本研究對EaIκBα基因進(jìn)行原核表達(dá)并檢測其在石斑魚各組織的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，EaIκBα基因在免疫組織血細(xì)胞、頭腎以及肝臟中都有較高的表達(dá)。經(jīng) LPS、溶藻弧菌和石斑魚虹彩病毒 SGIV刺激石斑魚后，對EaIκBα在頭腎中的表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，結(jié)果顯示其表達(dá)量都有不同程度的升高，表明EaIκBα在細(xì)菌和病毒的感