基于DNA酶和小分子連接DNA末端保護的蛋白質(zhì)熒光分析.pdf

1、蛋白質(zhì)是生命體的基本組成成分，是維持生命正常生理功能的重要活性物質(zhì)。蛋白質(zhì)與營養(yǎng)代謝、物質(zhì)運輸、機能防御、遺傳等生理活動密切相關(guān)。而且有研究表明，在疾病的發(fā)展過程中，一些特異性蛋白質(zhì)的表達與分布也會發(fā)生改變，因此蛋白質(zhì)的分析檢測對掌握蛋白質(zhì)的生理功能，研究蛋白質(zhì)參與的生理活動以及相關(guān)疾病的診斷、治療都具有重要意義。基于小分子配體和蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用的末端保護原理最近引起了蛋白質(zhì)研究工作者的廣泛興趣。末端保護是指首先將小分子配體連

2、接在DNA上，目標蛋白質(zhì)與小分子配體結(jié)合后，能夠阻止外切酶對連接小分子的DNA鏈進行消解。末端保護對DNA序列的編碼無限制，可以與各種基于核酸的擴增技術(shù)和檢測手段相結(jié)合，這為蛋白質(zhì)分子的靈敏檢測提供了新的途徑。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴設(shè)計了一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA探針。探針3'端標記有生物素（biotin）。當目標蛋白質(zhì)-鏈霉親合素（STV）不存在時，核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）能夠特異性地從3'端水解 DNA探針的雙鏈部分。未被水解

3、的探針的單鏈部分能夠形成DNA酶（DNAzyme）結(jié)構(gòu)。DNAzyme與加入的分子信標結(jié)合，在中間的RNA堿基處將分子信標切斷。分子信標上的熒光基團和猝滅基團因此而分離，熒光信號恢復(fù)。之后， DNAzyme又與新的分子信標結(jié)合，發(fā)生剪切作用，釋放熒光基團。DNAzyme不斷循環(huán)利用，直至全部的分子信標參與反應(yīng)，熒光信號達到最強。加入目標蛋白質(zhì) STV后， STV與biotin特異性結(jié)合，能夠阻止ExoⅢ從3'端水解DNA探針的雙鏈部分。

4、DNA探針仍然保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)，無法形成 DNAzyme。沒有 DNAzyme的作用，分子信標不能被切斷，保持熒光猝滅狀態(tài)。該方法通過熒光信號的降低對目標蛋白質(zhì)進行定量測定，可以檢測到低至50 pmol的STV。方法簡單快速，檢測成本低，但靈敏度還有待于進一步提高。⑵將與小分子連接的DNA探針設(shè)計成DNAzyme的序列。目標蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合后，末端受到蛋白質(zhì)保護，核酸外切酶Ⅰ（ExoⅠ）不能消解DNA探針。DNA探針保持DNAzyme結(jié)構(gòu)

5、，與加入的分子信標結(jié)合，切斷分子信標，釋放熒光信號。DNAzyme不斷循環(huán)利用，與新的分子信標結(jié)合，發(fā)生剪切反應(yīng)，釋放出越來越多的熒光基團，產(chǎn)生越來越強的熒光信號。當沒有目標蛋白質(zhì)出現(xiàn)時，DNA探針被ExoⅠ水解，DNAzyme結(jié)構(gòu)消失，加入的分子信標保持淬滅狀態(tài)，體系熒光信號很弱。通過檢測熒光信號的增長來實現(xiàn)目標蛋白質(zhì)的定量檢測。我們將該方法分別應(yīng)用于鏈霉親和素（STV）和葉酸受體（FR）的檢測，取得了良好的效果。該方法可以檢測到低至