小分子與DNA凸起結(jié)構(gòu)的作用和高效DNA酶的篩選.pdf

1、DNA是一類重要的生物大分子，其基本功能是作為遺傳信息的載體，并起復(fù)制、轉(zhuǎn)錄遺傳信息的功能。發(fā)現(xiàn)對核酸、蛋白質(zhì)等生物功能體系的生理過程具有調(diào)控作用的小分子，并以此為探針，研究小分子與生物靶分子的相互識別、相互作用和信息傳遞以及藥物與疾病的關(guān)系等具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 凸起結(jié)構(gòu)是DNA識別的一個重要主題。它的額外的沒有配對的核苷能夠與核酸結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，也能作為小分子化合物的結(jié)合位點(diǎn)。核酸凸起結(jié)構(gòu)在核酸的蛋白質(zhì)識別、移碼突

2、變、修復(fù)酶的非正常同源重組、反義RNA的生成、DNA三聯(lián)子重復(fù)序列的延伸合成等生物過程中具有重要的生物學(xué)意義。
　　 我們利用熒光光譜研究了R/S聯(lián)萘酚氨基糖與不同核酸序列的結(jié)合能力，表明了與DNA凸起結(jié)構(gòu)的結(jié)合能力；利用紫外光譜、圓二色光譜和SPR等檢測方式研究了吩噻嗪氨基糖與不同核酸序列的結(jié)合能力，研究結(jié)果表明與含有三個堿基凸起結(jié)構(gòu)的DNA序列的結(jié)合能力最強(qiáng)。利用SPR的方法，我們同樣得到了R/S聯(lián)萘酚氨基糖和吩噻嗪氨基糖與

3、含有ATT三堿基凸起結(jié)構(gòu)的DNA序列的解離常數(shù)。
　　 DNA凸起結(jié)構(gòu)的結(jié)合分子對三聯(lián)子重復(fù)序列的體外復(fù)制具有刺激作用。我們利用三聯(lián)子重復(fù)序列的體外復(fù)制體系，發(fā)現(xiàn)R/S聯(lián)萘酚氨基糖、吩噻嗪氨基糖、順式/反式偶氮苯氨基糖等對重復(fù)序列的復(fù)制具有不同程度的刺激作用。反式偶氮苯氨基糖對反應(yīng)具有促進(jìn)作用，而紫外光照后的順式偶氮苯氨基糖對反應(yīng)具有抑制作用。利用吩噻嗪氨基糖，對其他幾種單堿基重復(fù)序列，二聯(lián)和三聯(lián)重復(fù)序列在DNA聚合酶I Kle

4、now片段催化下的滑移合成進(jìn)行了探討。在吩噻嗪氨基糖化合物存在下，所有序列的滑移復(fù)制均被促進(jìn)。具有較不穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的序列均比具有形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列束滑出的產(chǎn)物更長。在不同的DNA聚合酶的催化下都能夠進(jìn)行滑移合成。
　　 利用DDI化合物檢測了不同長度的模板序列，非重復(fù)序列和反應(yīng)溫度等對三聯(lián)子重復(fù)序列體外復(fù)制擴(kuò)增的影響。發(fā)現(xiàn)一定的反應(yīng)時間內(nèi)，短的重復(fù)序列作為模板時更容易通過擴(kuò)增得到較長的產(chǎn)物。非重復(fù)序列能改變了重復(fù)序列的連

5、續(xù)性，能夠影響體外復(fù)制。升高反應(yīng)溫度有利于滑移的進(jìn)行。
　　 將吩噻嗪氨基糖、R/S聯(lián)萘酚氨基糖、不同構(gòu)型的DDI和一個新制癌菌素氨基糖在同樣的反應(yīng)條件下用于ATT/AAT重復(fù)序列的體外復(fù)制，發(fā)現(xiàn)小分子化合物對滑移的促進(jìn)能力不同。其中吩噻嗪氨基糖的效果最弱，R型聯(lián)萘酚和新制癌菌素氨基糖的效果相對最強(qiáng)。比較不同的小分子化合物與凸起結(jié)構(gòu)和滑移促進(jìn)能力，將有助于研究重復(fù)序列的滑移機(jī)制和靶向凸起結(jié)構(gòu)的小分子的設(shè)計(jì)。
　　 DNA

6、酶是具有催化活性的單鏈DNA，通常是通過體外分子進(jìn)化技術(shù)得到的。這種篩選同自然界的篩選是相似的，只是加速了篩選的時間過程。為了能夠被復(fù)制，這些分子必須能夠表現(xiàn)出想要得到的催化功能，這樣就能把這種分子與其他的分子分開。篩選得到的分子通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行放大。
　　 目前已知的DNA酶能夠催化許多的化學(xué)反應(yīng)，包括RNA切割，DNA連接和卟啉氧化等。但是它們的催化能力，通常比蛋白酶的催化能力低幾倍?？紤]到一個典型的體外篩選實(shí)驗(yàn)，一輪

7、的篩選過程只需要隨機(jī)序列來進(jìn)行單一底物的操作，如果一個DNA隨機(jī)序列庫在一個短的時間內(nèi)要催化超過一個反應(yīng)，只有那些具有高的催化活性，能夠多輪催化的核酸酶才能被篩選出來。我們挑選能夠進(jìn)行RNA切割的DNA酶作為模型實(shí)驗(yàn)，使用一個含有三臂的RNA作為底物，通過篩選得到的DNA酶在短時間內(nèi)催化三個RNA切割反應(yīng)。這樣得到的DNA酶將具有更高的酶活性。
　　 我們從一個200 pmol的N60的隨機(jī)序列起始，隨機(jī)序列的兩端各有一段固定序

8、列。利用一個寡核苷酸鏈作為模板將DNA隨機(jī)序列與三臂RNA底物進(jìn)行連接，具有酶活性的DNA切割后產(chǎn)生短的產(chǎn)物。將分離得到的短的產(chǎn)物利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大后再次進(jìn)行篩選，進(jìn)過12的篩選后得到具有RNA切割活性的DNA酶。
　　 DNA酶的活性中心的產(chǎn)生同樣含有凸起結(jié)構(gòu)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，小分子化合物對凸起結(jié)構(gòu)的結(jié)合可能影響DNA酶的結(jié)構(gòu)對酶的活性產(chǎn)生調(diào)控作用。設(shè)計(jì)和合成靶向凸起結(jié)構(gòu)的小分子化合物，能夠?qū)δ承┖型蛊鸾Y(jié)構(gòu)的生理過程產(chǎn)生調(diào)控，