課件：多基因病的分子遺傳學

1、多基因病的 分子遺傳學 唐吟宇,主要內(nèi)容：第一節(jié) 多基因病的一般特征第二節(jié) 多基因病的研究方法（重點難點）第三節(jié) 糖尿病的分子遺傳學,第一節(jié) 多基因病的一般特征,一 特征1、病種多: 如高血壓、冠

2、心病、動脈粥樣硬化、哮喘、高脂蛋白血癥、糖尿病、胃及十二指腸潰瘍、精神分裂癥、風濕病、癲癇、甲亢、 唇裂、腭裂、先天性心臟病等。,2、發(fā)病率高 （群體發(fā)病率）：家庭復發(fā)風險比較： 單基因遺傳?。?5%—50%， 多基因遺傳?。?%—10%。群體發(fā)病率比較： 單基因?。旱陀?/10000， 多基因?。撼^1/1000，有些1%—10%。,3、危害性大 （直接危害人類的生存與健康

3、） 4、病因復雜 ( 遺傳因素和環(huán)境因素） 5、微效性 6、累加作用 7、對其研究具有前沿性,,,多基因病是復雜疾病，遺傳因素有以下特點：1）參與發(fā)病的遺傳因素多于一個，每個基因通過對中間 性狀的影響直接或間接地促進疾病的發(fā)生；2）每個基因參與發(fā)病的程度不同，大多數(shù)基因的作用較小， 但也可由一個或幾個基因呈主基因效應；3）每個基因只賦予個體某種程度的易患性，但每個基因的 作用不足以致病，也并

4、非致病所需，需要多個基因累加 起來才會致病；4）各基因參與發(fā)病的機制可能是，各自對不同的代謝途徑 產(chǎn)生影響，疾病的最終發(fā)生是各基因在不同途徑作用的 綜合結(jié)果；5）各基因致病效應的累積加上環(huán)境因素的作用構(gòu)成了個體的 疾病易患性，當易患性超過一定閾值時即可導致疾病的發(fā)生。,二 概念（易患性與發(fā)病閾值） 1、 易患性（liability) 人群中易患性變異：呈正態(tài)分布。 2、

5、發(fā)病閾值（threshold)： 易患性達到或超過一定的限度后就 會發(fā)病，該限度的易患性即發(fā)病值。,,,群體的易患性平均值： 從該群體的發(fā)病率作出估計，即群體發(fā)病率是測量易患性平均值的依據(jù)。,3、 遺傳度 (heritability) 多基因病的易患性由遺傳因素和環(huán)境因素共同引起，其中遺傳因素所起作用的相對大小稱為遺傳度（heritability）。

6、,遺傳度提供的其他信息： 若通過患者同胞發(fā)病率計算的遺傳度高于其他親屬發(fā)病率計算的遺傳度，或者遺傳度超過100%，則提示單基因遺傳病的可能性。,三 復發(fā)風險的一般規(guī)律 1、 遺傳度高低； 2 、患者親屬級別：一級親屬的發(fā)病率 為群體發(fā)病率的開方值; 3、 家庭中患者數(shù)量; 4 、患者病情嚴重程度； 5、 近親婚配； 6、 性別。,第二節(jié) 多基因病的研究方法

7、 當前對多基因病的研究，主要是 尋找疾病的主基因，或易感基因， 并試圖闡明其遺傳機制。 主要方法： 關聯(lián)分析 (association study) 連鎖分析 (linkage analysis) 基因組篩查 (genomic scanning) 候選基因研究 (candidate gene study),一、關聯(lián)分析 (

8、association study) 比較患者組與對照組某遺傳標記出現(xiàn)的頻率，從而判斷遺傳標記與疾病關系的研究方法。,關聯(lián)分析，選擇與疾病代謝有關的蛋白或酶的基因作為候選基因，在其位置已知的情況下，首先選取該基因內(nèi)部或附近的多態(tài)性位點作為遺傳標記。然后進行病例-對照研究，比較病例組與對照組在遺傳標記位點等位基因出現(xiàn)的頻率，如果遺傳標記位點的頻率在病例組和對照組有顯著差異，則該標記與疾病關聯(lián)。 對于

9、復雜性狀的多基因病，關聯(lián)分析較連鎖分析更為有效。因為關聯(lián)分析研究對象是病人和正常人，無需家系資料；且更容易找出只有微弱效應的基因；即使顯示關聯(lián)的標記不是造成疾病的變異，但很可能與變異連鎖。因此關聯(lián)分析更適合于多基因遺傳模式。,,若差異極為顯著，則遺傳標記與疾病關聯(lián)。表明有三種可能：1、遺傳標記與致病基因座不在一 條染色體上；2、 遺傳標記與致病基因座在一 條染色體上；3、遺傳標記本身即致病基因座

10、（與 疾病的發(fā)生機理有直接的關系）。 遺傳標記主要是微衛(wèi)星DNA（STR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。,二、連鎖分析 (linkage analysis) 連鎖分析是分析兩基因在染色體上相互關系的方法，通常是應用已知位點的遺傳標記，在患者家系中進行分析，從而確定該致病基因在染色體上的粗略位置。,連鎖分析，是確定兩個遺傳標記或者更多遺傳標記之間的物理關系，以確定致病基因的位置。它根據(jù)生殖

11、細胞減數(shù)分裂時，染色體發(fā)生交換和重組的原理，如果標記與特定基因位于不同的染色體，那么向子代傳遞時，它們將會發(fā)生自由分離；反之，如果標記與特定基因位于同一染色體且相距較近，在傳遞過程中，它們將不會發(fā)生自由分離，而呈現(xiàn)共分離的現(xiàn)象（行為一致）。利用這個原理，如發(fā)現(xiàn)某個標記物與疾病存在（很強的）連鎖關系，則可將疾病相關基因確定在和該遺傳標記（非隨機）共同傳遞的區(qū)域。該方法的好處是它將致病基因限定在一個小的范圍內(nèi)，以便進一步尋找

12、引起疾病的突變。不足之處是，不能直接發(fā)現(xiàn)致病基因，且很難收集到合適的大家系。所以在探索多基因病相關基因的應用中受到一定限制。,三、基因組篩查 (genomic scanning) 是指在不需要事先了解該基因位置、生物學功能、致病機制的情況下，利用高密度的多態(tài)性標記，通過全基因組掃描，劃定與疾病相關的易感區(qū)域，再在此區(qū)域內(nèi)選擇適當?shù)亩鄳B(tài)性標記精細掃描，然后根據(jù)連鎖分析的方法，評價疾病與標記物的相關性，

13、從而定位與疾病相關的染色體區(qū)域或致病基因。,其流程如下：1、家系收集及基因組DNA提?。?、微衛(wèi)星標記或SNP標記的選擇；3、標記的引物合成和PCR擴增；4、電泳檢測（基因分型）；5、等位片段分析（通過電腦）；6、基因組掃描綜合分析：計算LODS值（兩基因 非隨機出現(xiàn)的概率與隨機出現(xiàn)的概率之比， 再取對數(shù)），若某個標記的LODS值大于3 （比值大于103），即可肯定標記與致病基因 連鎖，進

14、而將致病基因定位在標記所在區(qū)域內(nèi)。,,全基因組篩查：選擇并使用覆蓋23條染色體上的、密度適當?shù)倪z傳標記，結(jié)合家系進行分析； 部分基因組篩查：選擇并使用覆蓋某一條染色體或其部分區(qū)段上的、密度適當?shù)倪z傳標記，結(jié)合家系進行分析。,四、 候選基因研究(candidate gene study) 基于對代謝途徑的認識(已知代謝途徑）， 選擇關鍵酶的基因,作為疾病的候選

15、基因, 研究 其編碼順序或非編碼順序與疾病的關系。 即 研究患者中該基因的編碼序列是否有基因突變； 非編碼序列是否有多態(tài)性位點基因與調(diào)控關聯(lián) 或與調(diào)控連鎖。 確認或排除候選基因是否致病基因。 進而可能克隆疾病基因，用于基因診斷或 藥物生產(chǎn)。,綜上所述，目前對于多基因病易感基因的研究，主要有兩種方法： 1、候選基因策略的關聯(lián)分析； 2、全基

16、因組掃描的連鎖分析。,,比較：對于多基因病而言，關聯(lián)分析可能比連鎖分析更有效。因為關聯(lián)分析相對于連鎖分析更易找到只有很微小效應的基因。而且不需要很難找到的家系。 結(jié)論： 關聯(lián)分析更適合于多基因遺 傳的模式。,對幾種方法作選擇時需要考慮的因素： 家系、樣本數(shù)、經(jīng)費、已有資源、研究時間、疾病等。,第三節(jié) 糖尿病的分子遺傳學 糖尿?。╠iabetes mellitus，DM)，乃多

17、基因病復雜性的代表。是繼腫瘤、心血管疾病之后第3位嚴重威脅人類健康的重大疾病。全世界約有1. 5億多患者，其研究已經(jīng)成為世界性的難題。 可分為： 胰島素依賴性糖尿?。↖DDM） I 型糖尿病 T1DM 非胰島素依賴性糖尿?。∟IDDM）II型糖尿病 T2DM 占 90%

18、 發(fā)病率：城市近10%； 農(nóng)村3%。,糖尿病，其遺傳機制的復雜性歷來是遺傳學家頭痛的問題。 from headache to nightmare.,一、當前研究方法：1、候選基因法 確定一個或數(shù)個在糖代謝中起重要作用的酶的基因，在群體或家系中研究這個基因與發(fā)病的關系。 研究患者中該基

19、因的編碼序列是否有突變；非編碼序列是否有多態(tài)性位點與基因調(diào)控關聯(lián)或連鎖（不平衡）。以確認是否致病基因。,候選基因有：醛糖還原酶基因（AR）、血管緊張素—Ⅰ轉(zhuǎn)換酶基因（ACE）、血管緊張素原基因（AGT）、一氧化氮合成酶基因（NOS）、葡萄糖激酶基因（GCK）、胰島素基因、胰島素受體基因等。,2、遺傳標記排除作圖法（連鎖分析法） 尋找與糖尿病發(fā)病相關的分子遺傳學標記。通常對糖尿病家系進行

20、連鎖分析，確定或排除某一區(qū)段與糖尿病的尚未知的致病基因連鎖。這是對未知代謝途徑研究的有效方法。 以上兩種方法，既有區(qū)別，也有聯(lián)系。,I 型糖尿病相關基因位點比較肯定，主要有：IDDM1—15。 II 型糖尿病相關基因位點正在進行大量研究，現(xiàn)已報道的陽性重復位點主要有：20q12-13 、1q21-23 、 12p13、7q21 等。,二、主要候選基因或基因位點（一） HLA II

21、類抗原基因與 T1DM 的關聯(lián) 1、HLA基因譜 HLA是多基因家族中的超基因，位于6號染色體短臂。見示意圖。,,,復等位基因數(shù)： II類基因區(qū)有4個亞區(qū)，每個亞區(qū)的等位基因數(shù) 分別是：DP區(qū)6個、D區(qū)26個、DQ區(qū)9個、DR區(qū)20個。 一條染色體上的每個亞區(qū)內(nèi)都各有多個α、β鏈 基因，基因產(chǎn)物為糖蛋白。分別由各亞區(qū)α、β基因 合成α和β鏈，再形成非共價二聚

22、體。,2、HLA-DR 和 HLA-DQ 與 T1DM 的關聯(lián)（1）DR3、DR4、DRw6 DRw8與 T1DM 關聯(lián)。（2）DQ基因區(qū)與 T1DM 的相關性比DR基因區(qū)更強。 例如，0.2%的美國人為 T1DM 所困，而攜帶DR3和DR4的白人發(fā)病率是正常人的20倍。,（3）DQ β基因可能決定 T1DM 的易感性和耐受性。（4）可能有某單倍型的幾個位點共同參與了 T1DM 的易感性。,（二）

23、其它1型糖尿病的易感位點 IDDM2 胰島素基因 IDDM3 15q26 IDDM4 D11S1253-1374 IDDM5 6q25與雌激素受體基因連鎖 IDDM6 18S478 IDDM7 2q31(谷氨酸脫羧酶抗體基因） IDDM8 6q25-27 IDDM9 IDDM10 D10S193-588

24、 IDDM11 14q24.3-q31D14S67與糖尿病連鎖 IDDM12 D2S272(2q33)（細胞毒素相關因子） IDDM13 D2S164（2q24) IDDM15 6q21(與HLA連鎖）,,雖已報道15個易感位點，但還會有新 位點發(fā)現(xiàn)。還需要進行研究以便確認或排除。還需進一步精細定位，進而克隆易感基因，闡明易感基因的生物學功能。,（三）胰島素基因

25、 人胰島素基因位于11p15, 由1355bp組成，包括3個外顯子和2個內(nèi)含子。5’側(cè)翼區(qū)是調(diào)節(jié)順序，啟動子位于第一個外顯子上游25bp處，第一外顯子上游168bp—258bp之間的順序為增強子。該基因區(qū)稱為IDDM2。,胰島素是最為保守的生物大分子之一，哺乳類動物之間的胰島素基因結(jié)構(gòu)差異很小。 人胰島素基因突變很少發(fā)生在編碼區(qū)，因此，胰島素基因突變不是糖尿病的主要病因。,在胰島素基因5’側(cè)翼區(qū)，在距

26、轉(zhuǎn)錄起始點363bp處，有一個高度變異區(qū)（INS 5’HVR），其重復單位為14bp(ACAGGGGTGTGGGG),可將其作為一個遺傳標記。按此HVR的長度，可將其分為三型等位基因Ⅰ型等位基因：小于600bp 重復40多次Ⅱ型等位基因：600---1600bp 重復80多次Ⅲ型等位基因：1600---2470bp 重復160多次,三型基因按孟德爾方式傳遞，人群中存在六種基因型：Ⅰ/Ⅰ Ⅰ/Ⅱ Ⅰ/

27、Ⅲ Ⅱ/Ⅱ Ⅱ/Ⅲ Ⅲ/Ⅲ 在歐美（高加索人種），糖尿病患者Ⅰ型等位基因的頻率顯著高于對照。,（四）胰島素受體基因 胰島素作用于靶細胞需要胰島素受體與之結(jié)合。胰島素受體是一種質(zhì)膜糖蛋白，它由連接胰島素的兩個α亞單位和具有酪氨酸激酶活性的兩個β亞單位組成。,胰島素受體基因突變使受體與胰島素的結(jié)合性降低，產(chǎn)生靶細胞抵抗胰島素的現(xiàn)象，這主要是 T2DM 的特征。 總之，胰島素受體基

28、因突變可導致糖尿病，但基因的保守性，決定其也不是糖尿病的主要原因。,（五）葡萄糖激酶（GCK）基因 GCK存在于肝臟和胰島的β細胞，GCK對血糖的調(diào)節(jié)如下圖：,,,血糖（-）,,血糖（+）,,,β細胞葡萄糖感受器（胰島GCK）,,胰島素（+）,,肝葡萄糖感受器（+） （肝GCK）,,,如果GCK活性降低，正常代謝平衡出現(xiàn)紊亂，則導致血糖增高，引起糖尿病。,1、GCK基因結(jié)構(gòu)及多態(tài)性 GCK基因定位于7p13,

29、由12個外顯子，11個內(nèi)含子組成。這12個外顯子從5’向3’方向依次命名為1B、1H、1C、2、3、4、5、6、7、8、9、10，其中1B僅出現(xiàn)在胰島細胞，而1H和1C僅出現(xiàn)于肝細胞，其他外顯子在兩種組織內(nèi)相同。,,這種組織特異性是由基因的特異啟動子所決定的，即組織不同啟動子不同，在GCK基因的不同部位轉(zhuǎn)錄，形成各自特異的GCKmRNA。,在GCK基因區(qū)3’端處，發(fā)現(xiàn)3個（GC）n、2個（GA）n 不連續(xù)串聯(lián)重

30、復序列，即GCK微衛(wèi)星DNA多態(tài)性標志之一，稱為GCK-1。,現(xiàn)發(fā)現(xiàn)GCK-1含有七個等位基因，將含195bp的等位基因命名為Z，其他六種分別為Z+2、Z+4、Z+6、Z+8、Z+10、Z-15。它們的不同之處就在于上述不連續(xù)雙核苷酸重復序列長度不同，如Z+2含197bp,Z-15含180bp,依此類推。,2、GCK基因與 T2DM 的關聯(lián) 美國黑人Z+4等位基因與 T2DM 關聯(lián)，可看成該人群 T2

31、DM 的遺傳標記。 毛里求斯人Z+2等位基因與 T2DM 關聯(lián)。 白人、印第安人Z等位基因與 T2DM 負關聯(lián)。,3、GCK基因突變與MODY型糖尿病 目前已知，GCK基因突變是MODY的病因一：GCK基因第七外顯子發(fā)生無意義突變（Glu-279-----AM),即谷氨酸-----提前終止，或發(fā)生錯義突變（Gly-261-----Arg),即谷氨酰胺-----精氨酸。突變的GCK改變了與葡萄糖的親

32、合力，還引起細胞的ATP/ADP比值改變，干擾了胰島素的分泌，導致MODY發(fā)生。,（六）NOS基因 一氧化氮作為細胞信號傳遞的信使是近年來生命科學的重要成就，一氧化氮（NOS）合成酶基因與糖尿病的關系應受到關注。 人類NOS由多個基因編碼，可分為誘導型（iNOS）、神經(jīng)元型（nNOS）和內(nèi)皮細胞型（eNOS）。,,NOS是內(nèi)源性NO生成的限速酶。影響NO

33、S基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的因素都可以影響NO的生成。iNOS定位于17cen→q11.2區(qū)域，長約37kb，包含26個外顯子。nNOS定位于12q24.2-24.31,長約120kb，有28個外顯子。eNOS定位于7q35-36，長約21kb,有26個外顯子。,在糖尿病微血管并發(fā)癥鼠中發(fā)現(xiàn)eNOS表達下降，iNOS表達增加。iNOS基因啟動子區(qū)的一個多態(tài)性位點可能與歐洲人的2型糖尿病相關。在南非，觀測到nNOS基因的

34、7、9等位基因在2型糖尿病患者中顯著增多。在eNOS基因中發(fā)現(xiàn)四種突變可能影響糖尿病的微血管并發(fā)癥。,,我們研究了中國漢族人iNOS基因和eNOS基因微衛(wèi)星DNA各等位基因與2型糖尿病的關系。發(fā)現(xiàn)iNOS基因(CCTTT)14和(CCTTT)15與DM負相關；eNOS基因（CA）34與DM正相關。 對DM及其并發(fā)癥發(fā)生機制有了新的認識。有必要進一步研究正常人群和DM及微血管病變患者NOS基因編碼區(qū)的差異。,單核苷酸

35、多態(tài)性（SNPs）是穩(wěn)定的分子標志，基因編碼區(qū)的SNPs可引起密碼子改變，導致氨基酸變化并改變酶蛋白的構(gòu)象，致使原有功能喪失或降低。擬進行NOS基因的分子流行病學研究。,三、IDDM與NIDDM的遺傳流行病學 對于多基因病的基因分離，首先要回答有多少基因參與，是否有主基因的作用。 流行病學研究表明，IDDM和NIDDM都很可能有主基因的作用。 主基因到哪里去尋找呢？,要從大量的適合分析的患者家系中

36、去尋找。家系中有較多的患者，其遺傳背景又相近，應用分子生物學方法，有可能找到糖尿病的相關基因。 因此，家系是國家的重要遺傳學資源，國家對此進行嚴格的歸口管理。,IDDM已經(jīng)找到許多相關基因位點。NIDDM的研究進展緩慢。據(jù)計算，IDDM的λs值（同胞患病率/群體患病率）可達15以上，而NIDDM的λs值較低（有的僅3.5)。,在不同地區(qū)、不同民族，某些家系的NIDDM的λs值可能較高，有望構(gòu)成NIDDM的

37、亞型。 因此，對這些家系的核心家系，判明遺傳方式后，可用遺傳標記進行連鎖分析，排除或確認標記位點與NIDDM的連鎖關系，從而為基因定位和克隆提供依據(jù)。,基因研究要有適合的家系?！罢业胶玫募蚁等缤l(fā)掘到寶藏”這種說法并不夸張?？蛇x擇以下方法尋找易感基因： 1、大家系的連鎖分析 2、大量核心小家系的連鎖分析 3、患者同胞對分析,其它多基因病的分子遺傳學研究策略與糖尿病的研究相