線性評價評價試驗

1、,,,,線性評價及分析測量范圍的確定,09:37:25,1,,,,參考材料? NCCLS EP6-A2 ：Evaluation of Linearity of QuantitativeAnalytical Methods;Approved Guide-Second Edition? 《臨床檢驗方法確認與性能驗證》P153? WS/T 408-2012 《臨床化學設備線性評價指南》,09:37:25,2,,,

2、,09:37:25關于“確認” (Validation)?方法學研究或方法產(chǎn)品性能研究?由方法建立者或產(chǎn)品生產(chǎn)者完成?給出主要方法性能：―準確度(accuracy)―精密度(precision)―特異性(specificity)―檢測限和定量限(LOD and LOQ, "靈敏度")―線性(linearity)―耐變性(robustness)

3、... ...,3---陳文祥,,,,09:37:25關于驗證 (Verification)?對主要方法性能的證實?在引入新方法時進行?對配套系統(tǒng)，一般驗證下列指標：―準確度(accuracy)―精密度(precision)―可報范圍(reportable range)―參考區(qū)間(reference in

4、terval)?對非配套系統(tǒng)，驗證更為廣泛，除上述指標外：―分析特異性―分析靈敏度―任何其他必要指標[The U.S. CLIA],4---陳文祥,,,,概念? 線性范圍（Linear Range)是指系統(tǒng)最終的輸出值（濃度或活性）與被分析物的濃度成正比的范圍，此時的非線性誤差應低于允許誤差。? 分析

5、測量范圍（Analytical Measurement Range）方法直接測量標本，而不需要任何的稀釋、濃縮或者其它預處理等過程下，測量結(jié)果總誤差符合要求的分析物濃度的范圍。（CAP）? 符合方法學性能，測量總誤差滿足方法規(guī)定的性能指標。? 臨床可報告范圍（Clinically Reportable Range)是方法可采用對標本的稀釋、濃縮或者其他預處理用于擴展直接分析測量下的分析物值的范

6、圍。? 臨床有用性? 可報告范圍（Reportable Range）：實驗室可建立或驗證儀器或檢測系統(tǒng)測量相應的準確實驗結(jié)果值的范圍。（CLIA）,09:37:25,5,,,,測量區(qū)間（Measuring Interval）? 也稱（分析）測量范圍。? 測量程序可給出測量結(jié)果（數(shù)值）、由測量低限和測量高限構(gòu)成的閉區(qū)間；? 在此區(qū)間內(nèi)，測量總誤差滿足方法規(guī)定的性能指標。? 規(guī)定條件下，滿足特定的不確定要求時，

7、某一測量儀器（系統(tǒng)）測量同樣的量所給出的一系列數(shù)值。? 相關性能獲得確認的體外診斷設備的線性曾被稱作“可報告范圍”測量范圍（measuing range）:當測量系統(tǒng)的誤差處于規(guī)定的界限內(nèi)（如CV=10%)時，被測量值分布的高、低界限值間的范圍。,09:37:25,6,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,09:37:25,7,思考? 定量免疫（如化學發(fā)光，

8、免疫比濁），校準曲線并非直線，能否進行線性評價？1.61.41.210.80.60.40.20,0,1,2,3,4,5,6,,,,線性評價-EP6? 設備熟悉期：在控、校準、樣本準備等；? 注意生物安全防護；? 樣本（濃度水平）數(shù)量：?驗證：4-6個樣本，覆蓋線性范圍，3-4次測定；?建立（ Establishment）：9-11個樣本，超

9、出20-30%預期線性范圍，3-4次測定。,09:37:25,8,,,,? 樣本類型：混合病人樣本、用適當稀釋液稀釋的臨床樣本、加入分析物的混合臨床樣本、商品質(zhì)控物或校準物、水溶液等。避免干擾，盡量減少基質(zhì)效應。高濃度樣本可用說明書指定稀釋液稀釋成系列低濃度樣本。? 總體要求：為避免基質(zhì)效應對結(jié)果的影響，進行線性評價時所選用的樣品應與臨床實驗樣品相似，但不應對測定方法有明確的干擾作用，避免溶血、脂血、黃疸等

10、。? 評價的是理論值（實際濃度、相對濃度）與儀器給出的最終結(jié)果（而非儀器內(nèi)部的響應值）之間的線性關系。,09:37:25,9,,,,09:37:25可添加分析物,10,,,,09:37:25使用高低混合血清制備系列樣本采用足量的混合血清樣本時，準備如下：? X1: 低濃度混合血清，濃度接近或等于下限；? X5: 高濃度混合血清，濃度等于或接近上限；? X2: 3份X1 + 1份X5? X3:

11、 2份X1 + 2份X5? X4: 1份X1 + 3份X5,11,,,,濃度計算? 如果高/低濃度混合血清的值未知，可將每種混合血清編碼。編碼可代表每個血清的相對濃度。對于等濃度間隔樣品，編碼可用整數(shù)（如1、2、3、4與5）代表連續(xù)樣品。本實驗方案不需預先知道樣品濃度，在確定線性范圍時可使用樣品測定結(jié)果的均值。,09:37:25,12,,,,09:37:25,13,如所制備的中間濃度樣品不是等間隔，其濃度間隔間

12、的關系應明確，在測定時可以這些間隔間的相對比值做為X值。,,,,實驗程序? 一般要求：實驗人員必須熟練掌握儀器操作和維護程序、樣本準備方法和校準。? 全部實驗和數(shù)據(jù)采集宜在同一試驗批（run）內(nèi)或者相隔簡短的實驗批中完成（最后在一天內(nèi)完成）。樣本隨機排列。有顯著攜帶污染時，應用空白隔開樣本。每個濃度樣本重復測定3-4次。記錄分析結(jié)果。,09:37:25,14,,,,09:37:25實驗記錄表格

13、,15,,,,檢查離群點Dixon 方法? 將每個濃度4次按從大到小排列（Yi-1到Y(jié)i-4)? 計算極差 D = Yi-1 –Yi-4?計算 D1= (Yi-1-Yi-2)/D?計算 D4= (Yi-3-Yi-4)/D?D1或D4如果大于0.765（0.05)或0.889（0.01）則該點為離群點；,09:37:25,16,,,,,,,,,,,,,??x,?,s =,09:37:25,17,x

14、 =,x1 ? x2 ? x33,格拉布斯（Grubbs）法每組數(shù)據(jù)中有3個測定結(jié)果，分別記為 x1，x2，x3。1)將3個測定值按大小順序排列,最大值記為 xmax,最小值記為xmin;2)由3個測定值計算均值x和標準差s:,3,2,3i?1,i,? x,,,,,,,,,,,,,,,09:37:25,18,樣品測定次,顯著性水平α,數(shù)34,0.0501.1531.463,0.0251.155

15、1.481,0.0101.1551.492,0.0051.1551.496,3)根據(jù)可疑值 xmax或 xmin分別按下式計算統(tǒng)計量t：t1 = xmax?xsx? xmins5)如t值大于臨界值，則相應的可疑值為離群值。Grubbs檢驗臨界值表,,,,多項回歸分析? 將上述數(shù)據(jù)進行多項回歸分析，得出一級、二級與三級多項式，此步可采用統(tǒng)計學軟件（如S

16、PSS,SAS）完成。,階數(shù)一級,多項式 回歸自由度（Rdf）Y = a + b1X 2,二級三級,Y = a + b1X + b2X2Y = a + b1X + b2X2 + b3X3,34,09:37:25,19,,,,回歸方程的線性檢驗? t = bi/ SEi? 如三級多項式L

17、= 5，R = 2，Rdf = 4，df = 5*2-4 = 6。在t值表中尋找t界值（雙邊檢驗，α=0.05），如非線性系數(shù)無顯著性（p>0.05），則數(shù)據(jù)組被認為具線性，此時可對數(shù)據(jù)組進行精密度檢驗，精密度符合線性判斷要求時，數(shù)據(jù)分析結(jié)束并得出結(jié)論為數(shù)據(jù)組具有統(tǒng)計學線性或一階線性。如任一非線性系數(shù)具顯著性（p<0.05），數(shù)據(jù)組則為非線性。此時應進行臨床標準的線性與非線性檢驗。,09:37:25,

18、20,,,,非線性程度判斷----臨床標準的線性與非線性檢驗? 1.計算最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異值 (Average deviationfrom linearity, ADL ),09:37:25,21,,,,,,,,,,,,計算公式,ADL =,x 100%,L:,樣本數(shù),09:37:25,22,cp (x): 最優(yōu)擬合二階或三階方程的擬合值a+bx: 擬合一階方程的擬合值,L,2,?[p(x)?(a?bx)

19、]x?X,c ： 所有測定濃度測量數(shù)據(jù)的平均值 = (Y1+Y2+Y3+……+Yn)/n,,,,,,,,,,09:37:25,23,σ = ?,n?d ?1? yi: 各個測量值? p(xi): 最優(yōu)擬合方程的擬合值? n: 樣本數(shù)乘以重復次數(shù)(L x R)? d: 最優(yōu)擬合方程的階數(shù),[y,數(shù)據(jù)的精密度檢驗1.計算不精密度(σ/ %), 即最優(yōu)擬合方程的回歸標準誤(σ)和總平均濃度( )的百分比率。

20、2.最優(yōu)擬合方程回歸標準誤的計算公式n,i?1,i,? p(xi)]2,,,,,,,,,,,09:37:25精密度判斷,24,L?RC,? PctBnd,?c,,,,09:37:25例1,25,,,,擬合方程參數(shù),09:37:25,26,,,,精密度判斷? 也可通過查表4進行精密度檢驗，首先計算ADL值，得ADL=0，最優(yōu)擬合方程是一階d=1，在L×R = 20和σ/ 是

21、0.70% (約1%) 時，查表4得臨界值為5.4%, 且未標注字母“P”，表明測量數(shù)據(jù)的精密度好。至此，對數(shù)據(jù)組的統(tǒng)計學分析結(jié)束，得出結(jié)論為此組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學標準的線性或一階線性。,09:37:25,27,,,,09:37:25,28,不精密度和ADL的臨界值（PctBnd=5%，d=1或2階）,L 樣本數(shù),R,重復測量的次數(shù),σ,最優(yōu)擬合方程的回歸標準誤,,,,09:37:25,29,不精密度和ADL的臨界值（P

22、ctBnd=5%，d=3階）,,,,09:37:25例2,30,,,,09:37:25,31,? ?計算最佳擬合回歸標準誤σ=0.136, 總平均濃度 c =5.02, σ/c =2.71%。由ADL計算公式得ADL=2.32%?最優(yōu)擬合方程是二階d=2，在L×R=20和σ/c = 2.71% (在2%-3%之間) 時，查表4臨

23、界值為5.7%-6.1%沒有標注字母“P”，表明測量數(shù)據(jù)的精密度符合作線性評價的要求。ADL 為 2.32%, 小于臨界值5.7%-6.1%，表明數(shù)據(jù)組具有臨床可接受的非線性或二階線性。,,,,09:37:25例3,32,測定值,09:37:25,33,1009080706050403020100,0,1,2,3,4,5,6,樣品號,對數(shù)據(jù)組做圖表明數(shù)據(jù)

24、非常分散，因此先進行數(shù)據(jù)組精密度檢驗，假設一階方程為最優(yōu)? ?擬合方程，計算 σ/c=12.2%， 在 d=1， L×R =20

25、和 σ/c>9% 時，查表 4 顯示字母“P”。表明數(shù)據(jù)組精密度差，不能進行線性評價。,,,,09:37:25,34,,,,09:37:25,35,不精密度和ADL的臨界值（PctBnd=5%，d=1或2階）,L 樣本數(shù),R,重復測量的次數(shù),σ,最優(yōu)擬合方程的回歸標準誤,,,,線性回歸? 以分析物濃度為X軸，測定結(jié)果為Y軸，繪制X-Y線性圖：Y = aX +b，目測或進行統(tǒng)計學分析，判斷是否符合要求。

26、,09:37:25,36,,,,? 前提：實驗室設定cv 2%；非線性誤差5%? 直觀印象：無明顯離群點，重復測定數(shù)據(jù)間的偏差隨濃度增加而增加。,09:37:25舉例-lgM,37,,,,? D2/2 總和39.05，平均值7.81；平方根2.8，相當于總體的重復性標準差（SD）；百分差值的SD為 0.9%；? 隨機誤差0.9%，分析析誤差一般小于2%（2SD），但是也有可能超過(TE=Bias+1.

27、65SD).,09:37:25,38,,,,09:37:25回歸分析,39,,,,比較直線方程預期值與最近擬合曲線預期值,? 低、中、高濃度測定結(jié)果超過5%，結(jié)論：非線性。,09:37:25,40,,,,09:37:25lgM,41,,,,09:37:25IgM偏差圖,42,,,,09:37:25Ca,43,,,,09:37:25Ca,44,,,,09:37:25Ca-多項式

28、回歸,45,,,,? 偏差超過非線性誤差（0.2）；決定舍去第6點，用1-5進行評價。如果1-5符合要求，則其線性為4.65-15.4,09:37:25預測值偏差比較,46,,,,09:37:25,47,,,,09:37:25,48,,,,? t0.05,7=2.365,09:37:25Ca-舍去第6點，多項式回歸,49,,,,? 偏差小于0.2，在4.65-15.4范圍內(nèi)，符合線性要求。,09:37:25

29、預期值比較,50,,,,09:37:25,51,,,,09:37:25,52,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,y = 1.024x - 0.011R² = 0.999,-5,20151050,0,5,10,15,20,25,09:37:25TC-線性評價25,53,,,,09:37:25SPSS結(jié)果,54,,,,09:3

30、7:25最佳擬合曲線和直線回歸相比,55,,,,09:37:25,56,,,,可報告范圍的確定? 分析測量范圍（Analytical Measurement Range）方法直接測量標本，而不需要任何的稀釋、濃縮或者其它預處理等過程下的分析物值的范圍。（CAP）?符合方法學性能，測量總誤差滿足方法規(guī)定的性能指標。? 臨床可報告范圍（Clinically Reportable Ran

31、ge)是方法可采用對標本的稀釋、濃縮或者其他預處理用于擴展直接分析測量下的分析物值的范圍。?臨床有用性? 可報告范圍（Reportable Range）：實驗室可建立或驗證儀器或檢測系統(tǒng)測量相應的準確實驗結(jié)果值的范圍。（CLIA），也被稱為線性范圍 （Linear Range）,09:37:25,57,,,,實驗內(nèi)容? 濃度水平：5個（或以上）；? 材料：標準溶液、廠家或者PT機構(gòu)

32、提供的線性材料；（混合）患者樣本、添加分析物；,????,稀釋液：水、生理鹽水、牛蛋白或者血清白蛋白溶液、低濃度樣本、空白血清。制備稀釋物的程序：如前述，高低濃度樣本比例混合；重復測定次數(shù)：3次數(shù)據(jù)分析：繪圖，手工繪制通過所有點的最佳直線，如果不能通過所有點，應首先通過較低濃度點；對于直線不通過的點，估算非線性的系統(tǒng)誤差。將系統(tǒng)誤差與該濃度的預期隨機誤差（2s）之和與TEa相比較。,09:37:2

33、5,58,,,,09:37:25膽固醇舉例? 數(shù)據(jù) mg/dL,59,,,,y軸為均值與x軸為指定值的圖形,09:37:25圖形? y軸為均值與x軸為指定值的圖形,60,,,,線性范圍可延伸到400mg/dL,09:37:25,61,,,,P158? A．X軸標記為0%, 25%, 50%, 75%和100%稀釋物。? B．Y軸標記為基于平均值或試驗檢測范圍的適當水平。? C．繪制【 (0

34、%，混合物1均值), (25%，混合物2均值), (50%，混合物3均值), (75%，混合物4均值), (100%，混合物5均值)】坐標。? D．畫出通過數(shù)據(jù)點的最佳直線給出頭3個坐標更多權(quán)重。? E．檢查線性圖，直觀地作出可報告范圍的決定。,09:37:25,62,,,,09:37:25誤差量化可報告范圍工作表,63,,,,校準驗證? 是以患者樣本相同的方式檢測已知濃度的材料證實在整個患者試驗結(jié)果

35、可報告范圍之內(nèi)儀器或檢測系統(tǒng)的校準情況（CLIA）。? 包括至少最低（或零）值，中值和最大值接近范圍的上限來驗證實驗室檢測系統(tǒng)試驗結(jié)果可報告范圍；? 至少每6個月進行一次，及不論何時出現(xiàn)下列情況時：? 試劑批號的改變，除非實驗室能證實并沒有影響用于報告患者試驗結(jié)果的范圍，以及室內(nèi)質(zhì)控值并沒有受到試劑批號改變的影響。? 進行了重大的保養(yǎng)維護或關鍵部件的替換，可能影響試驗性能。? 室內(nèi)質(zhì)控出現(xiàn)異常

36、的趨勢或偏移，或超出實驗室的可接受界限，及其他評價和糾正方法未能識別和糾正的問題。? 實驗室已建立的驗證患者試驗結(jié)果可報告范圍的計劃要求更經(jīng)常性地校準驗證。,09:37:25,64,,,,09:37:25NCCL校準驗證? 評價儀器：? 貝克曼、日立、Olympus AU? 樣本數(shù)5個? 樣本重復測定次數(shù)：5,65,,,,驗證1? 驗證1：校準線的斜率與1、截距與0無統(tǒng)計學差異，校準

37、驗證的測定值在可接受范圍內(nèi)，分析檢測系統(tǒng)的校準有效。,09:37:25,66,,,,驗證2? 校準線的斜率與1或截距與0有統(tǒng)計學差異，但所有校準驗證的測定值在可接受的范圍內(nèi)，分析檢測系統(tǒng)的校準有效.,09:37:25,67,,,,差異1? 校準線的斜率與1、截距與0無統(tǒng)計學差異，但校準驗證測定值至少有一個超過了可接受范圍，分析檢測系統(tǒng)校準無效。反映出有隨機誤差,09:37:25,68,,,,差異2?