熒光定量pcr在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,內(nèi)容提要,一、基因診斷技術(shù)簡(jiǎn)介二、乙型肝炎的病原檢測(cè)三、丙型肝炎的病原檢測(cè)四、性病相關(guān)病原體的檢測(cè),基因診斷技術(shù)簡(jiǎn)介,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4 基因診斷,3 免疫學(xué)診斷,臨床診斷,細(xì)胞膜,細(xì)胞核,DNA,轉(zhuǎn)錄,mRNA,翻譯,蛋白質(zhì),1 形態(tài)學(xué)診斷,2 生化診斷,,概念,PCR與基因診斷技術(shù),基因診斷即通過(guò)核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)直接檢測(cè)基因的存在狀態(tài)或缺陷對(duì)疾病

2、作出診斷的方法。Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)通過(guò)兩個(gè)短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶的作用，可在3個(gè)小時(shí)內(nèi)把特定的DNA片段擴(kuò)增1000萬(wàn)倍。 九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面開(kāi)展，1998年，熒光定量PCR技術(shù)開(kāi)始在中國(guó)應(yīng)用于臨床檢測(cè)。,熒光定量PCR技術(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)

3、整個(gè)PCR過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。,熒光染料：SYBR Green I、EVA Green熒光探針：TaqMan、 Hybridization Probes 、Molecular Beacon,熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),特異性強(qiáng)：直接擴(kuò)增病原體的特異DNA或異?；蚱戊`敏度高：可檢測(cè)到極少量的DNA，有效降低漏診率高效省

4、時(shí)：擴(kuò)增周期短，有利于快速診斷取材范圍廣：血清、痰液、體液、毛發(fā)等多種樣本全封閉反應(yīng)：無(wú)需PCR后處理，降低污染定量準(zhǔn)確：利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，采用對(duì)數(shù)期分析自動(dòng)化程度高：操作安全，避免人為判斷,RocheLightCycler,,,,,熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用,病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測(cè)性病相關(guān)病原體（CT、NG、UU、HPV）的基因檢測(cè)優(yōu)生優(yōu)育項(xiàng)目診斷：人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒

5、II型（HSV）、弓形蟲（TOX）、風(fēng)疹病毒其它病原體檢測(cè)：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等,乙型肝炎的病原檢測(cè),乙肝病毒,,HBV的感染過(guò)程,乙肝如何傳染？,慢性HBV感染,病毒持續(xù)6個(gè)月未被清除者免疫耐受期：HBV復(fù)制活躍免疫清除期非活動(dòng)或低復(fù)制期,慢性乙型肝炎,HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎HBeAg陰性慢性乙型肝炎,乙型肝炎肝硬化,代償期肝硬化失代償期肝硬化,HBsAg與抗HBs,HBsAg

6、在感染HBV兩周后即可陽(yáng)性。只要HBsAg陽(yáng)性就可診斷HBV感染，陰性則不能排除HBV感染?？笻Bs為保護(hù)性抗體，陽(yáng)性表示對(duì)HBV有免疫力。,HBsAg和抗HBs同時(shí)陰性： 即所謂窗口期，此時(shí)HBsAg和抗HBs都未產(chǎn)生。HBsAg和抗HBs同時(shí)陽(yáng)性： HBV感染恢復(fù)期，此時(shí)HBsAg未消失，抗HBs已產(chǎn)生?；蛘呤莵喰透腥尽?為什么HBsAg陰性不能排除HBV感染？,窗口期檢測(cè)試劑不夠靈敏隱匿性慢性乙肝（S基因

7、變異）重疊HCV感染（干擾HBsAg合成）,抗HBs陽(yáng)性就萬(wàn)無(wú)一失了嗎？,單一抗HBs陽(yáng)性HBV DNA檢出率0-11.8%先后感染了不同的HBV亞型HBV病毒S基因變異,如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染？,提高檢測(cè)敏感性采用針對(duì)變異抗原的檢測(cè)試劑HBV DNA的檢測(cè)！,HBeAg與抗HBe,HBeAg的存在表示病毒復(fù)制活躍且有較強(qiáng)的傳染性。HBeAg消失而抗HBe產(chǎn)生稱為血清轉(zhuǎn)換。抗HBe陽(yáng)轉(zhuǎn)后，病毒復(fù)制水平低，傳

8、染性降低。但長(zhǎng)期抗HBe陽(yáng)性者并不代表病毒復(fù)制停止或無(wú)傳染性，研究顯示20%～50%仍可檢測(cè)到HBV DNA，部分可能由于前C區(qū)基因變異，導(dǎo)致不能形成HBeAg。,HBeAg與抗HBe共存？,處于血清轉(zhuǎn)換過(guò)程中野生株與變異株同時(shí)存在,HBeAg水平與HBV DNA的關(guān)系,HBeAg陽(yáng)性標(biāo)本HBV DNA檢出率90％左右HBeAg與HBV DNA有著良好的相關(guān)性,HBeAg陰性/抗HBe陽(yáng)性/HBV DNA陽(yáng)性,HBV DNA水

9、平一般較低HBV低水平復(fù)制HBV病毒前C區(qū)基因變異重疊HCV感染,“兩對(duì)半”缺陷,“兩對(duì)半”是機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)，為間接指標(biāo)?！皵y帶者”、“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”等免疫學(xué)指標(biāo)不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。HBsAg陰性或HBeAg陰性不能排除HBV感染。,HBV DNA,是病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志。HBV DNA定量對(duì)于判斷病毒復(fù)制程度、傳染性大小、病毒藥物療效等有重要意義。,HBV DNA拷貝數(shù)＝乙肝病毒載量,HBV

10、 DNA檢測(cè)的臨床意義,HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBV DNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBV DNA對(duì)乙肝兩對(duì)半起補(bǔ)充作用HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)HBV DNA可檢測(cè)出隱匿性慢性乙型肝炎,提供直接證據(jù)縮短“窗口期”,有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷,HBV DNA檢測(cè)的臨床意義,,HBV DNA檢測(cè)的臨床意義,調(diào)查表明并不是所有“大三陽(yáng)”的病人

11、都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽(yáng)”的病人HBV都無(wú)復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過(guò)檢測(cè)HBV DNA來(lái)決定。,HBV DNA檢測(cè)方法,斑點(diǎn)雜交（基本淘汰）定性PCR（基本淘汰）熒光定量PCR（主流）基因芯片（將來(lái)？）,為什么建議病人要進(jìn)行HBV DNA檢測(cè)？,熒光定量PCR方法檢測(cè)HBV感染的各期,,HBsAg和HBeAg均陽(yáng)性而HBV DNA陰性？,干擾素或拉米夫定等治療后病

12、毒復(fù)制受抑制。PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對(duì)結(jié)合。病毒DNA整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游離HBV DNA很少或缺乏。,乙肝的治療,目前尚無(wú)一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達(dá)到50％左右。目前國(guó)際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類： ?干擾素：重組人α-1b干擾素、α- 2a、

13、 α-2b干擾素等。 核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。,乙肝的治療,主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化等對(duì)于HBV DNA≥105的患者應(yīng)進(jìn)行抗病毒治療,拉米夫定,可迅速降低HBV DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻斷肝纖維化的進(jìn)程，終止肝硬化的發(fā)展。尤其是拉米夫定不受病毒感染的模式、野生型或基因組前C區(qū)突變的影響。此外拉米夫定還能抑制肝移植受體和AIDS病人體內(nèi)的HBV復(fù)制。,拉米夫

14、定治療人群,有明顯HBV DNA復(fù)制者前C區(qū)變異的慢性乙型肝炎代償期的慢性乙型肝炎接受肝臟移植的患者干擾素治療失敗,拉米夫定治療效果,絕大多數(shù)患者HBV DNA水平顯著下降。用藥4周開(kāi)始下降，12至16周約半數(shù)以上的病例血清HBV DNA降到可檢測(cè)水平以下。治療1年后HBeAg陰轉(zhuǎn)率約為20%。,病毒學(xué)應(yīng)答：HBV DNA低于檢測(cè)下限血清學(xué)應(yīng)答生化學(xué)應(yīng)答組織學(xué)應(yīng)答,應(yīng)用抗病毒藥物后如何判斷療效？,應(yīng)用抗病毒藥物后如何判

15、斷療效？,治療結(jié)束時(shí)完全應(yīng)答隨訪1年持續(xù)應(yīng)答無(wú)應(yīng)答,YMDD變異,YMDD：酪氨酸－蛋氨酸－天門冬氨酸－天 門冬氨酸蛋氨酸（M）突變?yōu)楫惲涟保↖）或纈氨酸（V）形成YIDD變異株或YVDD變異株 。,抗病毒治療中存在的問(wèn)題,,HBV-YMDD變異檢測(cè)的臨床意義,動(dòng)態(tài)檢測(cè)：服用拉米夫定3個(gè)月開(kāi)始，每月 檢測(cè)1次提前發(fā)現(xiàn)：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前1-4個(gè)

16、 月檢測(cè)出突變株及時(shí)調(diào)整：適時(shí)調(diào)整用藥方案，防止因耐 藥而導(dǎo)致病情惡化,丙型肝炎的病原檢測(cè),丙肝病毒,HCV是單鏈RNA病毒主要通過(guò)血液和血制品傳播感染后易轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝谆虬l(fā)展為肝硬化、肝癌呈全球性分布，約1%普通人群感染,抗HCV IgM和抗HCV IgG,HCV抗體不是保護(hù)性抗體，是存在HCV感染的標(biāo)志?？笻CV IgM在發(fā)病后即可檢測(cè)到，一般持續(xù)1

17、～3個(gè)月。如果抗HCV IgM持續(xù)陽(yáng)性，提示病毒持續(xù)復(fù)制，易轉(zhuǎn)為慢性。低滴度抗HCV IgG提示病毒處于靜止?fàn)顟B(tài)，高滴度提示病毒復(fù)制活躍。,HCV抗原檢測(cè)的困難,HCV在血液中含量極低，僅為HBV的1%HCV病毒顆粒很難有效地分離純化、人工合成抗原丙型肝炎的窗口期很長(zhǎng)，血清學(xué)檢測(cè)無(wú)法早期診斷抗體持續(xù)性存在，無(wú)法提示正確的病毒載量HCV的型別復(fù)雜，高突變率HCV核心抗原檢測(cè)試劑盒敏感性差：45.68%,HCV RNA,HCV

18、 RNA陽(yáng)性是病毒感染和復(fù)制的直接標(biāo)志。HCV RNA的定量測(cè)定有助于了解病毒復(fù)制程度、抗病毒治療的選擇及療效評(píng)估等。,HCV RNA熒光定量PCR檢測(cè)的臨床意義,早期診斷：在免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”或一部分不產(chǎn)生抗體的丙肝病毒攜帶者，都可出現(xiàn)HCV RNA陽(yáng)性，抗HCV陰性的檢測(cè)結(jié)果。彌補(bǔ)ELISA方法的高漏檢率,HCV RNA可作為HCV感染診斷的指標(biāo)。HCV RNA定量可指導(dǎo)用藥，為療效觀察及預(yù)后判斷提供客觀指標(biāo)?？笻CV不能作

19、為抗病毒療效的指標(biāo)。慢性丙型肝炎長(zhǎng)期抗HCV陽(yáng)性，這只表示曾經(jīng)感染了丙肝病毒并出現(xiàn)了相應(yīng)的免疫應(yīng)答，并不代表體內(nèi)仍有丙肝病毒的存在或復(fù)制，這時(shí)只能通過(guò)HCV RNA定量檢測(cè)鑒別丙肝病毒的活動(dòng)性和復(fù)制程度。HCV主要通過(guò)輸血和血制品傳播，對(duì)獻(xiàn)血員及血制品進(jìn)行檢測(cè)，以減少醫(yī)源性丙型肝炎的發(fā)生和傳播。,核酸檢測(cè)在HCV感染的診斷中要比HBV感染的診斷重要得多！,性病相關(guān)病原體的檢測(cè),性病在我國(guó)已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，自99年以來(lái)，性

20、病的發(fā)生率居高不下，其發(fā)病率在傳染性疾病中位居第3位，03年我國(guó)累計(jì)報(bào)道性病病例數(shù)（HIV除外）73萬(wàn)。浙江省為高發(fā)區(qū)，位居全國(guó)第三。,常見(jiàn)性傳播疾病病原體,淋病雙球菌(NG)沙眼衣原體(CT)解脲支原體(UU)人類乳頭瘤病毒(HPV)人類免疫缺陷病毒(HIV),淋病雙球菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法,涂片染色：對(duì)于女性患者檢出率低，易出現(xiàn)假陰性分離培養(yǎng)：培養(yǎng)較困難，生化鑒定復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)ELISA抗原檢測(cè)法：存在交叉反應(yīng)，非特異反應(yīng)較嚴(yán)重

21、,熒光定量PCR檢測(cè)NG的優(yōu)勢(shì),可在短時(shí)間內(nèi)快速、準(zhǔn)確地直接從臨床各種標(biāo)本中檢出含量極低的病原菌對(duì)女性疑似淋球菌引起的各種炎癥的診斷及鑒別診斷起決定性作用對(duì)癥狀輕者或無(wú)癥狀的淋球菌感染者做到早期診斷和鑒別診斷可用于療效考核,沙眼衣原體,沙眼衣原體感染與致病,近年來(lái)在歐美等國(guó)，沙眼衣原體的感染率和危害性已超過(guò)淋球菌在我國(guó)，在非淋球菌性尿道炎中居首位泌尿生殖道感染，妨礙妊娠盆腔感染，可致生殖能力損害,傳統(tǒng)方法檢測(cè)沙眼衣原體的缺陷

22、,“窗口期”檢測(cè)不出不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染,熒光定量PCR檢測(cè)衣原體的優(yōu)勢(shì),靈敏度98%以上、特異性100%提高陽(yáng)性檢出率適用于感染的早期診斷和無(wú)癥狀攜帶者的檢查,解脲支原體,UU難以分離，需特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)，操作費(fèi)時(shí)，需1-3天才能得到初步結(jié)果。血清學(xué)檢查，僅10%UU尿道炎患者在病程中特異性抗體滴度升高4倍，使其方法學(xué)應(yīng)用受限。一些非致病的脲原體或培養(yǎng)過(guò)程中的污染都可能導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果。,傳統(tǒng)方法檢測(cè)解脲支原體的缺

23、陷,具有高度的敏感性和特異性，提高陽(yáng)性檢出率快速、定量準(zhǔn)確，可以為臨床評(píng)價(jià)療效提供依據(jù),熒光定量PCR檢測(cè)支原體的優(yōu)勢(shì),CT、UU是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的PCR檢測(cè)試劑盒，作為首選方法，在臨床推廣應(yīng)用,人類乳頭瘤病毒,有100多個(gè)型只能感染人的皮膚和黏膜上皮細(xì)胞，人是HPV的惟一宿主免疫原性低，易形成持續(xù)性感染新生兒產(chǎn)道感染,HPV,,傳統(tǒng)巴氏涂片漏診率可達(dá)30%從細(xì)胞學(xué)水平來(lái)觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，其中80%的患者確診時(shí)已是宮頸癌

24、晚期,傳統(tǒng)方法檢測(cè)HPV的缺陷,早期感染的病原檢測(cè)可對(duì)HPV進(jìn)行分型可以評(píng)估病毒載量與患癌癥風(fēng)險(xiǎn)可以考核療效與預(yù)后用于HPV感染與生殖器腫瘤相關(guān)性的研究,熒光定量PCR檢測(cè)HPV的優(yōu)勢(shì),人類免疫缺陷病毒,是引起艾滋病的病原體,可判定無(wú)癥狀且血清陰性患者潛在的HIV傳播性檢測(cè)長(zhǎng)潛伏期的HIV攜帶者使“窗口期”縮短10天在治療過(guò)程中觀察患者血清HIV載量的變化預(yù)示病情的轉(zhuǎn)歸和指導(dǎo)臨床用藥對(duì)于新生兒是否從母體感染HIV的診斷尤

25、為適用,熒光定量PCR檢測(cè)HIV,小結(jié),熒光定量PCR是特異、靈敏、高效的基因診斷技術(shù)對(duì)致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測(cè)彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷（如HCV）縮短診斷的窗口期（如HIV），利于早期診斷,對(duì)治療過(guò)程進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)指導(dǎo)用藥過(guò)程及劑量，以制定合理的療效方案定量PCR的臨床應(yīng)用可結(jié)合臨床表現(xiàn)，并與傳統(tǒng)的免疫學(xué)、影像學(xué)等診斷方法來(lái)綜合評(píng)判，更為科學(xué),小結(jié),04年6月，衛(wèi)生部臨檢中心主任申子瑜、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院副院長(zhǎng)尚紅等專家對(duì)迪