hplc在藥代動力學(xué)中的應(yīng)用

1、,,,,HPLC在藥代動力學(xué)中的應(yīng)用,藥代動力學(xué),實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備,LC-MS/MS分析,結(jié)果分析,,,,,,,— By:@花生PPTer —,主要內(nèi)容,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,藥物代謝動力學(xué)（Pharmacokinetic，PK）是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收Absorption、分布Distribution、代謝Mechanism和排泄Excretion規(guī)律，并運(yùn)用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化的規(guī)律

2、的一門學(xué)科。,機(jī)體對藥物的作用,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,不同劑型對藥物吸收的影響不同人種（或人群）對藥物代謝的影響不同人群對藥物排泄的影響,指導(dǎo)藥物開發(fā),指導(dǎo)后期臨床試驗(yàn),指導(dǎo)臨床合理用藥,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,吸收（absorption）：藥物自給藥部位進(jìn)入血液循環(huán)的過程。消化道吸收（口腔，胃腸道吸收）消化道外吸收（注射，呼吸道，皮膚粘膜吸收） 順序：靜脈、吸

3、入、腹腔注射、舌下含化、肌肉注射、皮下注射、口服、直腸給藥、外敷。,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,吸收入血的藥物隨血流轉(zhuǎn)運(yùn)到各組織器官的過程。,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,藥物在體內(nèi)發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)改變的過程意義：1、利于藥物排泄 2、改變藥理活性：,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,藥物及代謝物從排泄或分泌器官排出體外的過程。腎臟（主要） 腸 肺 皮膚 唾

4、液 乳汁等,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,反應(yīng)藥物經(jīng)歷轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)化，血藥濃度（量）隨著時間（時）的推移而發(fā)生變化的動態(tài)規(guī)律。描述這一規(guī)律的曲線,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,在傳統(tǒng)中藥藥代學(xué)的研究中，76%的報道中使用了HPLC/MS/MS技術(shù)，24%使用了HPLC/ESI-MS技術(shù)。靈敏，快速，選擇性高，效率高中藥的有效成分中藥材不同藥材中同一成分,藥代動力學(xué),實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備,LC

5、-MS/MS分析,結(jié)果分析,,,,,,,— By:@花生PPTer —,主要內(nèi)容,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法同時 測定黃芩素，黃芩甙，木蝴蝶素A和漢黃芩素在大鼠血漿中的含量,,,— By:@花生PPTer —,,,本次實(shí)驗(yàn)，是利用液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法，快速，準(zhǔn)確地測出大鼠血漿中的黃芩素，黃芩甙，木蝴蝶素A和漢黃芩素含量，以解釋其藥代動力學(xué)性質(zhì)。,,,,,,,,,,— By:@花生PP

6、Ter —,,,是一種多年生草本植物栽培黃芩inKorea。這種植物的根在傳統(tǒng)的東方醫(yī)學(xué)治療各種疾病,包括發(fā)燒,潰瘍、炎癥和癌癥。含有黃芩各種各樣的黃酮,phenylethanoids、氨基酸、植物固醇和精油。黃芩苷,黃芩甙元oroxyiln和漢黃芩素(圖1)是黃芩的主要有效成分這些類黃酮具有抗過敏[2]、抗氧化劑(3、4),抗艾滋病毒(5、6),抗炎[7],抗腫瘤(8 - 10),抗焦慮藥[11],[12]和antigenotoxic

7、 anti-hepatitis B病毒活動[13]。,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,黃芩是一種多年生草本植物，它的根在傳統(tǒng)的東方醫(yī)學(xué)中被用于治療各種疾病，包括發(fā)熱，潰瘍，炎癥和癌癥。它含有各類黃酮，氨基酸，植物固醇和精油，其中的主要活性成分是黃芩苷，黃芩甙，木蝴蝶素A和漢黃芩素，它們具有抗氧化，抗過敏，抗病毒，抗焦慮等有顯著的作用。,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,黃芩甙元、漢黃芩素和木蝴蝶

8、素的分離我們之前的方法[13],以及他們的純度是99.0%。黃芩苷是從西格瑪化工有限公司(圣。路易斯,密蘇里州,美國)。2 -(3、4-Dimethoxy-phenyl)5、7-dihydroxychromen -4號(DPDC,純度為99.0%,內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))是由東亞藥業(yè)有限公司(龍仁市、韓國)。甲醇和乙酸乙酯(高效液相色譜級)獲得Burdick &杰克遜Inc .(美國MI馬斯基根)和其他化學(xué)物質(zhì)是最高質(zhì)量的,,,,,,,,,,

9、— By:@花生PPTer —,,,分別將baicalein, baicalin, oroxylin A,wogonin的原溶液和DPDC加入DMSO中，DPDC的添加量為1mg/1ml。 將原溶液用乙腈稀釋，得到工作溶液. DPDC溶液（0.1微克/毫升）由儲備的等量溶液經(jīng)乙腈稀釋得到。 所有的已配置好的溶液都在聚丙烯小試管中避光置于4℃下一周。,,,,,,,,,,— By:

10、@花生PPTer —,,,通過將將工作溶液按比例配置，得到含量分別為5, 10, 20, 50, 100, 200 and 500 ng/ml的baicalein, oroxylin A,wogonin大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)液和含量分別為5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 and 5000 ng/ml的baicalin大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)液。 通過分別將25微升0.24, 2.40,

11、8.00微克/ml工作溶液添加到475微升大鼠血漿中，得到12.0, 120 和 400 ng/ml的QC溶液 最后將各配置溶液以50微升，分別置于聚丙烯小試管中，并保存于-20℃直到分析開始。,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,50個單位的大鼠血漿和QC樣品標(biāo)準(zhǔn)混合10 l 10%抗壞血酸是一種抗氧化劑(31日),0.05的350 l mhydrochloric酸、5 l DPDC乙腈解決

12、方案和1000 l在1.5 ml-polypropylene乙酸乙酯管的混合物在13000×g centrifuged 5分鐘。有機(jī)層是pipette-transferred和蒸發(fā)使用真空干燥集中器。殘留的溶解在40 l sonicating 3分鐘,50%的甲醇centrifuged。aliquots(10 l)注入質(zhì)/女士系統(tǒng)。,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,取50毫升大鼠血漿標(biāo)準(zhǔn)液，并混合以QC和

13、10微升10%抗壞血酸作為抗氧化劑。再加入350微升0.05M鹽酸，5微升DPDC于乙腈溶液中，并加入1000微升乙酸乙酯于1.5ml的聚丙烯小管中?；旌衔镫x心（13000xg）5分鐘。分離有機(jī)層并干燥。溶解殘渣于40微升50%甲醇并靜置3分鐘，再度離心。取上清液10微升加入LC-MS/ms系統(tǒng)。,藥代動力學(xué),實(shí)驗(yàn)材料及準(zhǔn)備,LC-MS/MS分析,結(jié)果分析,,,,,,,— By:@花生PPTer —,主要內(nèi)容,,,,,,,,,,— B

14、y:@花生PPTer —,,,色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性定量功能結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。,安捷倫液相色譜/離子阱質(zhì)譜系統(tǒng),在線真空脫氣機(jī),二元或四元梯度液相泵,自動進(jìn)樣器,柱溫箱,二極管陣列檢測器,,,,,,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,（分離、定量和定性） 黃芩苷，千層紙素A和漢黃芩素，大鼠血漿

15、中黃芩活性成分的測定。 經(jīng)過液液萃取與2 - （3,4 - 二甲氧基 - 苯基）-5,7 - 二羥基 - 色烯-4 - 酮作為內(nèi)標(biāo)物，黃芩素，黃芩，千層紙素A和漢黃芩素是從一個洗脫色譜柱C18于7分鐘，由甲醇和0.1％甲酸的等度流動相柱（60:40， V / V） 。被檢測的分析物使用電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,LC-MS/MS分析

16、 色譜系統(tǒng)由NANOSPACE的 SI-2泵（高壓輸液泵），SI-2自動進(jìn)樣器和一個S-MC系統(tǒng)控制器，固定相C18柱（5微米，2.1mm內(nèi)徑×100mm），流動相使用甲醇的混合物中， 并0.1％甲酸（60:40，V / V），流速0.2毫升/分鐘，色譜柱和自動進(jìn)樣器托盤溫度分別為50?C和4?C，時間為7.0分鐘，洗脫液被直接引入串聯(lián)的正電離電噴霧源四極桿質(zhì)譜儀。,ESI是近年來出現(xiàn)

17、的一種新的電離方式。它主要應(yīng)用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。它既作為液相色譜和質(zhì)譜儀之間的接口裝置，同時又是電離裝置。它的主要部件是一個多層套管組成的電噴霧噴嘴。最內(nèi)層是液相色譜流出物，外層是噴射氣，噴射氣常采用大流量的氮?dú)?，其作用是使噴出的液體容易分散成微滴。另外，在噴嘴的斜前方還有一個補(bǔ)助氣噴嘴，補(bǔ)助氣的作用是使微滴的溶劑快速蒸發(fā)。在微滴蒸發(fā)過程中表面電荷密度逐漸增大，當(dāng)增大到某個臨界值時，離子就可以從表面蒸發(fā)出來。離子產(chǎn)生后，借助于噴嘴

18、與錐孔之間的電壓，穿過取樣孔進(jìn)入分析器。加到噴嘴上的電壓可以是正，也可以是負(fù)。通過調(diào)節(jié)極性，可以得到正或負(fù)離子的質(zhì)譜。產(chǎn)物離子被轉(zhuǎn)換為采用量化。,,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,,,錐電壓分別為35V的黃芩素，33V的千層紙素A和漢黃芩素28V的黃芩苷和55V的DPDC。（？）Multiplereaction- 監(jiān)測（MRM）模式下使用的特定前體/產(chǎn)物離子被轉(zhuǎn)換為采用量化。,藥代動力學(xué),實(shí)驗(yàn)

19、材料及準(zhǔn)備,LC-MS/MS分析,結(jié)果分析,,,,,,,— By:@花生PPTer —,主要內(nèi)容,,,,baicalein, oroxylin A, wogonin and DPDC（三種待測物與內(nèi)參物）的電噴霧電離產(chǎn)生豐富的質(zhì)子化分子離子（ [MH] + ）為質(zhì)荷比（m / z） ：271.2 ， 285.3 ， 285.3和315.0 ，,這些碎片離子被生產(chǎn)作為突出的產(chǎn)品離子分別是：黃芩素M / Z 123 （三羥基苯基部分） ，

20、M / Z 271 （黃芩[MH] +離子損失葡萄糖醛酸部分），M / Z 270漢黃芩素（[MH] +離子損失甲基） ，對于M / Z 270 （[MH] +離子損失甲基基團(tuán)）千層紙素A和M / Z 299 （[MH] +離子損失甲基基團(tuán)）為DPDC 。,,,,,,,,,— By:@花生PPTer —,用該色譜法分離黃芩素，黃芩苷，千層紙素A和漢黃芩素的保留時間是約4.36 ， 2.59 ，5.17和6.17分鐘，良好的分辨這四個類黃

21、酮。,,,,校準(zhǔn)曲線是通過濃縮，得到黃芩素，千層紙素A和漢黃芩素范圍和黃芩苷濃度為5.0-5000納克/毫升的大鼠血漿。對于低CV值（CV=方差/均值）黃芩素（ 3.6 ％ ） ，黃芩（ 5.7 ％ ）的斜坡上，千層紙素A（ 2.6 ％ ）和漢黃芩素（3.0％）所表示的方法的可重復(fù)性（表1） 。,,,,,服務(wù)管理,Service management,,,— By:@花生PPTer —,批內(nèi)和批間CV值分別為：黃芩素0.8-6.1 ％

22、，千層紙素為一1.7-5.2 ％，漢黃芩素1.4-5.9 ％，黃芩苷1.6-4.1 ％。日內(nèi)和批間的RE值為-4.0至4.2％的黃芩素（baicalein）， -1.3至1.7％千層紙素A（oroxylin A）和-3.8-5.8％漢黃芩素（ wogonin）， -1.7-1.7％黃芩苷（baicalin）。這些結(jié)果表明本方法具有可接受的準(zhǔn)確性和精確度。(如Table 2),,,,,服務(wù)管理,Service management,,,—

23、 By:@花生PPTer —,提取回收黃芩素，黃芩苷，千層紙素A和漢黃芩素的加標(biāo)大鼠血漿測定采用一步法液 - 液萃取，用乙酸乙酯在酸性pH濃度為15.0 ， 75.0和在400納克/毫升重復(fù)六次?；厥章史謩e為黃芩素82.8-87.1 ％ ，黃芩苷和71.1-76.9 ％ ，千層紙素為一81.5-83.2 ％漢黃芩素為81.4-84.7 ％ （表3） 。 DPDC的回收率為76.3 ± 4.7 ％ 。,,,,,服務(wù)管理,Serv

24、ice management,,,— By:@花生PPTer —,加工穩(wěn)定性（凍融和短期）和色譜法（再注入）進(jìn)行了測試，并證明是影響不大（表4） QC樣品，通過去3次凍融循環(huán)顯示出可接受的準(zhǔn)確度（RE：-5.8?5.3％）和精密度（CVs：≤6.0％）。QCs顯示可接受的準(zhǔn)確度（RE：-5.0?3.3％）和精密度（變異系數(shù)：≤5.9％）時，暴露在室溫下4小時紫外線屏蔽下的燈光。的重組的再分析在4?c下貯存24小時提取物表現(xiàn)出可接受的精度

25、（RE：-7.8?3.0％）和精確度（變異系數(shù)：≤3.9％）的質(zhì)量控制樣本。,,,,,服務(wù)管理,Service management,,,— By:@花生PPTer —,此法已成功地用于藥物動力學(xué)。如右圖所示：圖4顯示的平均血漿黃芩素，黃芩苷，千層紙素A和漢黃芩素的濃度隨時間變化的曲線。,如右圖所示可看出：AUC,t1/2,MRT,Vss andCl of baicalein were 32.1±4.9g min/ml, 31

26、6±77.1 min,118±11.2 min, 15.3±3.59 l/kg and 129±20.2 ml/min/kg,,,— By:@花生PPTer —,,,結(jié)論 這一種靈敏，可靠的LC-MS/MS法同時測定黃芩素，黃芩苷，千層紙素A和漢黃芩素大鼠血漿中已研制成功并驗(yàn)證使用液 - 液萃取作為樣品的處理步驟。這種檢測方法被證明了可以接受的靈敏度（ LLOQ ：5.