液質(zhì)聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　液質(zhì)聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 農(nóng)業(yè)資源

2、與環(huán)境 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　[摘要] 孔雀石綠是食品安全領域里繼蘇丹紅后在國

3、際上引起轟動的又一高危物品，其具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用，不僅對食用水生動物和人類健康造成威脅，而且使我國水產(chǎn)品出口因孔雀石綠殘留問題屢遭貿(mào)易壁壘。本實驗建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定水產(chǎn)品中孔雀石綠(MG)及其代謝物隱色孔雀石綠(LMG)殘留量的快速、準確檢測方法。該法在GB/T19857-2005檢測標準的基礎上，采用空白魚肉樣品添加不同質(zhì)量濃度標準溶液進行加標回收率計算，結(jié)果采用內(nèi)標

4、法定量，以氘代孔雀石綠(MG-D5)和氘代隱色孔雀石綠(LMG-D6)為對應的同位素內(nèi)標物。結(jié)果表明，該方法用于水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠的測定快速，準確，精密度好，回收率高，能夠很好的滿檢測要求。且MG和LMG兩種待測物在1～50.0ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好(相關系數(shù)R2>0.99)，方法檢出限均為0.5μg/kg，在加標量為0.5、2.0和10.0μg/kg 水平下，空白魚肉加標樣品回收率均大于70%，相對標準偏差RS

5、D均小于10%。</p><p>　　[關鍵詞] 孔雀石綠 水產(chǎn)品 食品安全 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜</p><p>　　Rapid residue determination of malachite green in aquatic products by UPLC-MS/MS</p><p>　　[Abstract] Malachite G

6、reen is another high-risk items in the field of international food safety, which has high toxins, high residue and carcinogenic, teratogenic, mutagenic and other side effects, it’s not only a threat to edible aquatic ani

7、mals or human health, but also it is export trade barriers because of malachite green residues in aquatic products.We developed a rapid and accurate method by UPLC-MS/MS to determine the residue of malachite green(MG) an

8、d their metabolites LMG in aquatic pro</p><p>　　[Keywords] Malachite green aquatic products food safety UPLC-MS/MS </p><p>　　當今世界，人類面臨著人口、資源、環(huán)境三大問題，面對21世紀誰來養(yǎng)活中國人的問題，我國在大力開發(fā)利用海洋生物資源的同時，也大力發(fā)

9、展水產(chǎn)養(yǎng)殖，減輕對海洋水產(chǎn)品資源的過分依賴，同時也緩解人口增加而帶來的食品、資源等一系列問題。水產(chǎn)養(yǎng)殖是我國國民經(jīng)濟的重要組成部分，為國民經(jīng)濟建設和人民生活水平提高做出了重要貢獻，但隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，食用水產(chǎn)品質(zhì)量等問題迅速暴露出來，水產(chǎn)養(yǎng)殖中存在水體污染與濫用各種漁藥與添加劑等情況，使得環(huán)境保護與水產(chǎn)品品安全成為困擾人類并亟待解決的問題。近年來,“孔雀石綠”事件的頻繁發(fā)生，日益引起社會各界的廣泛關注。水產(chǎn)養(yǎng)殖是我國國民經(jīng)濟的重要組

10、成部分，但隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖中存在水體污染與濫用各種漁藥與添加劑等情況，使水產(chǎn)品質(zhì)量問題日益凸顯，水產(chǎn)品安全成為捆饒人類并亟待解決的問題并引起當今社會各界的廣泛關注。我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)大國，又是水產(chǎn)品的出口大國，藥物殘留已成為水產(chǎn)品出口的主要障礙，尤其是孔雀石綠的殘留，號稱蘇丹紅第二，在魚體內(nèi)長時間殘留，且具有高毒性、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用，不僅對食用水生動物和人類健康造成威脅，而且使我國水產(chǎn)品出口因孔雀石綠<

11、;/p><p><b>　　1. 關于孔雀石綠</b></p><p>　　孔雀石綠是食品安全領域里繼蘇丹紅以后在國際上引起轟動的又一高危物品，其具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用?？兹甘G(MG)是一類三苯甲烷類染料,最先應用在紡織工藝,后因其具有消毒性和殺菌性而廣泛用于水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過程，因其低價高效,當前還找不到特效藥完全取代而在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應用?？兹?/p>

12、石綠的分子式：C23H25ClN2，相對分子質(zhì)量：364．9,其在水生生物體中的主要代謝產(chǎn)物為隱色孔雀石綠，分子式：C23H26N2，相對分子質(zhì)量：330.48。</p><p>　　l.1 孔雀石綠代謝和殘留</p><p>　　孔雀石綠進入動物機體后，通過生物轉(zhuǎn)化，而轉(zhuǎn)變成脂溶性的隱色孔雀石綠，其在動物體內(nèi)代謝很慢，并不斷蓄積，即使在魚卵孵化中使用孔雀石綠防治水霉病，也會在魚種或咸魚中

13、檢出[2]。孔雀石綠進入水生動物體內(nèi)，會快速的代謝成脂溶性的隱色孔雀石綠。0.1mg/L孔雀石綠藥浴歐鰻24h，藥浴6h鰻魚體內(nèi)孔雀石綠殘留達到峰值，72 h后鰻體內(nèi)孔雀石綠90%被代謝，720h有些魚體內(nèi)檢測不出孔雀石綠。而隱色孔雀石綠在藥浴72h達到峰值，然后緩慢代謝，720h只代謝了50%，2400h后魚體肌肉中仍有15±12μg/kg檢出。翟毓秀等[2]報道，孔雀石綠主要在受精卵和魚苗的血清、肝、腎、肌肉和其他組織中蓄

14、積。通過對鲇魚的孔雀石綠藥浴實驗證明，在7d內(nèi)，孔雀石綠從687μg/kg消減到17μg/kg，而隱色孔雀石綠則從814μg/kg消減到451μg/kg。邱緒建等[3](2006)，對鯽魚以200mg/L濃度孔雀石綠進行藥浴1h，隱色孔雀石綠殘留從6 h以后，呈非常平緩的下降趨勢，消除時間較長，至30d時仍有17.7/μg/kg 的殘留。對用濃度為0.8mg/L的孔雀石綠溶液藥浴1h的大菱鲆，孔雀石綠在大菱</p><

15、;p>　　1.2 孔雀石綠毒性和危害</p><p>　　孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠有較大的毒副作用[27]，會引起魚類消化道、鰓和皮膚輕度發(fā)炎，妨礙腸道酶分泌。在水體中能夠溶解足夠的鋅，引起水生動物鋅中毒。更為嚴重的是孔雀石綠在魚體內(nèi)殘留時間長，是一種致癌、致畸、致突變的藥物，對人類造成潛在危害?？兹甘G及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠的毒性是其結(jié)構(gòu)所決定的。因其分子中的與苯基相連的亞甲基和次甲基受苯環(huán)影響

16、有較高的反應活性，可生成自由基一三苯甲基等代謝產(chǎn)物衍生物及初級和次級的代謝產(chǎn)物，均具有與致癌芳香胺類似的結(jié)構(gòu)，而其進人人體后，會穿透細胞膜，到達細胞核中的DNA，從而產(chǎn)生活潑的親電子“陽氮離子”，攻擊DNA上的親核位置，相互以共價鍵結(jié)合，破壞DNA引起癌變。</p><p>　　1.2.1 孔雀石綠對水生動物的毒性和危害</p><p>　　水生動物對孔雀石綠均很敏感，其安全質(zhì)量分數(shù)一般在

17、0.1mg/L以下[6]。孔雀石綠能引起魚類的鰓和皮膚上皮細胞輕度炎癥，能使腎管腔有輕度擴張，腎小管壁細胞的胞核擴大，影響魚腸中酶的分泌，從而影響魚的攝食及生長。孔雀石綠對水生動物的毒性還表現(xiàn)在致癌、致畸、致突變方面。有研究表明，孔雀石綠的濃度增加1倍，其致死率可增加20倍，孔雀石綠是一種劇毒物[7]?？兹甘G用于虹鱒后可導致基因突變、致癌、染色體破碎、畸形和繁殖能力下降，虹鱒長期使用孔雀石綠后發(fā)現(xiàn)魚卵發(fā)育異常，受精38 h后胚胎成活率

18、顯著下降，孵化時間延長，脊柱、頭、鰭、和尾發(fā)育異常[4]?？兹甘G能使淡水魚魚卵染色體發(fā)生異常，孔雀石綠的質(zhì)量分數(shù)低于1mg/mL，仍能使兔和魚繁殖致畸；當孔雀石綠的質(zhì)量分數(shù)高于0.2mg/L時，對軟體動物東風螺的受精卵或是幼體都會造成不同程度的發(fā)育畸形。周立紅等[7]認為，孔雀石綠可使鳙魚和尼羅羅非魚的紅細胞產(chǎn)生微核，當質(zhì)量分數(shù)為0.5mg/L時，微核率分別達到0.133%和0.0717%，且微核率隨藥物質(zhì)量分數(shù)的升高而提高。<

19、/p><p>　　1.2.2 孔雀石綠對人和哺乳動物的毒性</p><p>　　孔雀石綠對人類和哺乳動物具有高毒性和高致癌性[14]?？兹甘G與隱色孔雀石綠均能使大鼠的肝細胞空泡化，無色孔雀石綠還能使甲狀腺濾泡上皮大量凋亡，減少公鼠甲狀腺激素的釋放；還能抑制血漿膽堿脂酶產(chǎn)生作用，可能造成乙酰膽堿的蓄積而出現(xiàn)神經(jīng)癥狀[4]?？兹甘G的化學官能團是三苯甲烷，其分子中與苯基相連的亞甲基和次甲基受苯環(huán)

20、影響有較高的反應活性，可生成自由基一三苯甲基， 同時孔雀石綠也能抑制人類谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶的活性，兩者均能造成人類器官組織氧壓的改變，使細胞凋亡出現(xiàn)異常，誘發(fā)腫瘤和脂質(zhì)過氧化，而來源于上皮組織的惡性腫瘤即為“癌”[8]。楊先樂等[4]報道，孔雀石綠能使培養(yǎng)的倉鼠胚胎細胞產(chǎn)生過多的自由基造成脂質(zhì)過氧化；孔雀石綠能抑制培養(yǎng)的原始鼠肝臟細胞DNA和EGF的合成，誘使乳酸脫氫酶的釋放，誘使肝臟腫瘤的發(fā)生；孔雀石綠能通過促進增殖細胞核抗原(PC

21、NA)和GUS期細胞周期蛋白的表達而誘發(fā)大鼠肝臟腫瘤。美國國家毒理學研究中心研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠隱色孔雀石綠728d，其肝臟腫瘤明顯增加。</p><p>　　由于MG具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點，當其進入生物體內(nèi)，會產(chǎn)生具有更強危害的隱色孔雀石綠(LMG)，因此，包括中國在內(nèi)的許多國家都將MG列為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥物。然而，由于MG具有價格低廉、效果顯著等優(yōu)點，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用屢禁不止，這不但對

22、人體健康造成威脅，而且嚴重影響了中國水產(chǎn)品的出口；我國也于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動物。因此，如何快速、準確地測定該類禁用藥物，特別是其代謝物在水產(chǎn)品中的殘留量，對于水產(chǎn)品出口企業(yè)非常重要。</p><p>　　1.3 孔雀石綠的檢測方法</p><p>　　當前國家檢測標準之一的GB/T 19857—2005，要求孔雀石綠在水產(chǎn)

23、品中的檢出率不得超過1μg/kg，比歐盟標準還要嚴格[10]。國家規(guī)定采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的殘留量均不得超過0.5μg/kg，而采用高效液相色譜法測定兩者的殘留量不得超過2μg/kg，比水產(chǎn)行業(yè)標準中SC/T 3024—2004規(guī)定的用高效液相色譜法測定孔雀石綠<2μg/kg，隱色孔雀石綠<4μg/kg的標準還要嚴格 。</p><p>　　1.3.1 樣品的前處

24、理選擇</p><p>　　樣品采集和前處理是目前環(huán)境分析化學的瓶頸，它制約著環(huán)境分析化學的發(fā)展，而且往往是測定誤差的主要來源。因此，樣品的前處理技術(shù)是目前環(huán)境分析化學研究的難點和熱點之一?？兹甘G樣品的前處理過程通常采用液液萃取或者固相萃取等。固相萃取是一種基于液相色譜分離機制的樣品前處理方法。該法利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品中的基體和干擾化合物分離，然后用洗脫液洗脫，從而達到分離與凈化目

25、標化合物的目的。其主要分離模式有正相SPE(吸附劑極性大于洗脫液極性)、反相SPE(吸附劑極性小于洗脫液極性)、離子交換SPE和吸附SPE。SPE具有有機溶劑用量少、便捷、安全、高效等特點，正在不斷地被國內(nèi)外專家進行痕量孔雀石綠樣品的預處理中。</p><p>　　1.3.2 檢測方法選擇</p><p>　　目前孔雀石綠的檢測以理化檢測法和免疫學檢測法為主[15]。理化檢測包括薄層層析法

26、、分光光度法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(LC)、液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)檢測法(LC—MS)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC—MS)；免疫學檢測主要用酶聯(lián)免疫檢測法。而高效液相色譜法(HPLC)因具有快速高效、高靈敏度等優(yōu)點，同時國內(nèi)檢測此類藥物的標準方法有GB/T19857-2005、GB/T20361-2006[18]和SN/T1768-2006等。液相色譜方法存在前處理復雜、加標回收率不高和檢測限較高等缺點，氣相色譜方法同樣存在著前處

27、理操作步驟多、耗時較長、費用高及檢測過程使用大量有毒試劑等缺點[28]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法與其他色譜檢測技術(shù)相比，具有更高的選擇性和靈敏度，自動化強等優(yōu)點，可以很好的降低孔雀石綠及其代謝物作的檢測限值，且更好滿足為水產(chǎn)品中禁用藥物的檢測要求，已成為測定孔雀石綠的首選方法[29]。因此，在GB/T19857-2005檢測方法的基礎上，結(jié)合本實驗室的超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜對水產(chǎn)品中MG及其代謝物LMG的殘留量進行檢測，該方法快

28、速、準確、靈敏度高，完全可以達到水產(chǎn)品出</p><p>　　2. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法</p><p><b>　　2.1 原理</b></p><p>　　試樣中的殘留物用乙腈提取后，經(jīng)中性氧化鋁固相萃取柱凈化后用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量。</p><p>　　2.2 試劑及其配制</p

29、><p>　　(除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為重蒸餾水)</p><p>　　2.2.1 色譜純乙腈。</p><p>　　2.2.2 色譜純甲醇。</p><p>　　2.2.3 無水乙酸銨。</p><p>　　2.2.4 色譜純甲酸。 </p><p>　　2.2.5 5mmol/L

30、乙酸銨緩沖溶液：稱取0.385g無水乙酸銨溶解于1000mL水中，甲酸調(diào)pH到4.5，過0.22μm濾膜。</p><p>　　2.2.6 中性氧化鋁柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。</p><p>　　2.2.7 標準品：孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、同位素內(nèi)標氘代孔雀石綠（MG -D5）、同位素內(nèi)標氘代隱色孔雀石綠（LMG-D6），純度大于98%，德國Dr公司生產(chǎn)

31、。</p><p>　　2.2.8 標準儲備溶液：準確稱取適量的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氘代孔雀石綠、氘代隱色孔雀石綠標準品，用乙腈分別配制成100μg/mL的標準貯備液。</p><p>　　2.2.9 標準中間溶液(1μg/mL)分別準確吸取1.00mL孔雀石綠、隱色孔雀石綠的標準儲備溶液（2.2.8）至100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，1mL該溶液分別含1μg的孔雀石綠、隱色孔雀

32、石綠，-18℃避光保存。</p><p>　　2.2.10混合標準使用溶液(100ng/mL)：用乙腈稀釋混合標準儲備溶液，配制成每毫升含孔雀石綠、隱色孔雀石綠均為100ng的混合標準儲備溶液，-18℃避光保存。</p><p>　　2.2.11混合內(nèi)標標準溶液：用乙腈稀釋標準中間溶液(2.2.8)，配制成每毫升含氘代孔雀石綠和氘代隱色孔雀石綠各100ng的內(nèi)標混合溶液，-18℃避光保存。

33、</p><p>　　2.2.12混合標準工作溶液：根據(jù)需要，臨用時吸取一定量的混合標準使用溶液(2.2.10)和混合內(nèi)標標準溶液(2.2.11)，用乙腈-5mmol/L乙酸銨溶液(1+1)稀釋配制適當濃度的混合標準工作液，每毫升該混合標準工作溶液含有氘代孔雀石綠和氘代隱色孔雀石綠各2ng。</p><p><b>　　2.3儀器和設備</b></p>

34、<p>　　2.3.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源)，超高效液相色譜為Waters Accurity UPLC，三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜為Waters Premier XE，均為美國沃特世公司生產(chǎn)。</p><p>　　2.3.2 超聲波清洗器SK2510HP，上?？茖С晝x器有限公司。</p><p>　　2.3.3 旋渦振蕩器，德國IKA公司。</

35、p><p>　　2.3.4 固相萃取裝置，美國supelco公司。</p><p>　　2.3.5 SL-502N型臺式天平，上海華巖設備儀器有限公司。</p><p>　　2.3.6 Centrifuge5810臺式高速離心機，德國艾本德公司。</p><p>　　2.3.7 R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海精勝科學儀器有限公司。</

36、p><p>　　2.3.8 AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。</p><p>　　2.3.9 IKAT18基本型組織搗碎機，德國IKA公司。</p><p><b>　　2.4實驗方法</b></p><p><b>　　2.4.1樣品提取</b></p><

37、;p>　　稱?。?±0.02）g已搗碎樣品于50mL聚丙烯塑料離心管中，加入200μL混合內(nèi)標標準溶液（1.2.11），加入11mL乙腈，超聲波振蕩提取2min，8000r/min勻漿提取30s，4000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至25mL比色管中;另取一50ml離心管加入11mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10s，洗滌液移入前一離心管中，用玻棒搗碎離心管中的沉淀，漩渦混勻器上振蕩30s，超聲波振蕩5min，4000r/m

38、in離心5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，搖勻備用。</p><p><b>　　2.4.2凈化</b></p><p>　　移取5.00mL樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱（2.2.6）上，用雞心瓶接收流出液，4mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2mL的乙腈-5mmol/L乙酸銨（1+1）溶解，超聲振蕩2

39、min，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。</p><p>　　2.5超高效相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜上機分析測定</p><p>　　研究采用了超高效液相色譜儀和1.7μm填料的超高效液相色譜柱對樣品進行分離，與傳統(tǒng)的高效液相色譜柱相比，該法能更好地使待測物與抑制電離的基質(zhì)分離，降低基質(zhì)對質(zhì)譜檢測的影響，同時提高分離效率。對于電噴霧離子源正離子掃描模式，流動相在弱酸性環(huán)境條件下加入

40、適量乙酸銨可以提高待測物離子化效率，因此，試驗中采用乙腈和5 mmol乙酸銨溶液(pH=4.5)作為流動相體系，并且對流動相比例進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當乙腈和乙酸銨溶液初始比例為50:50梯度洗脫條件下(表1)，待測物在3min內(nèi)全部出峰，并且靈敏度高、分離效果好，滿足檢測要求。</p><p>　　2.5.1 超高效液相色譜條件</p><p>　　色譜柱為ACQUITY UPLCTM B

41、EH C18柱(2.1mm×100 mm，1.7μm)；流動相：溶劑A為乙腈，溶劑B為5 mmol乙酸銨溶液(pH4.5)，梯度洗脫條件見表1；樣品室溫度10℃ ；色譜柱溫40℃；進樣體積10μL；流速0.3 mL/min。</p><p><b>　　表1 梯度洗脫條件</b></p><p>　　Table 1 Gradient elution con

42、ditions</p><p><b>　　2.5.2質(zhì)譜條件</b></p><p>　　電噴霧離子源ESI+；毛細管電壓3.5 kV；二級錐孔電壓3.0V，離子源溫度120℃；脫溶劑氣溫度380℃，錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑氣流量600 L/h。第一重四極桿和第二重四極桿的低端分辨率及高端分辨率均為13.0；碰撞氣流量0.2 mL/min；錐孔電壓、碰撞能量及

43、監(jiān)測離子對見表2，檢測方式為多反應監(jiān)測(MRM)掃描模式。</p><p>　　表2 MRM多反應監(jiān)測質(zhì)譜條件</p><p>　　Table 2 MRM conditions for multiple reaction monitoring mass spectrometry</p><p>　　2.5.3 標準品測定</p><p>

44、;　　按照表1和表2的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定不同濃度的混合標準工作溶液，按內(nèi)標法定量并繪制標準曲線和計算相關系數(shù)。</p><p>　　2.5.4 樣品測定</p><p>　　按照表1和表2的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定樣品溶液，計算樣品溶液中非定量離子對與定量離子對色譜峰面積的比值，并與標準品比較，僅當兩者數(shù)值的相對偏差小于25%時方可確定兩者為同一物質(zhì)。</p&

45、gt;<p>　　2.6結(jié)果計算和表述 </p><p>　　按式（1）計算樣品中孔雀石綠與隱色孔雀石綠殘留量。計算結(jié)果需扣除空白值。 </p><p>　　C×Ci×A×Asi×V ...</p><p>　　X= —————————— （1）</p><p>　　Csi

46、5;Ai×As×W ... </p><p><b>　　式中： </b></p><p>　　X ── 樣品中待測組分殘留量，μg/kg； </p><p>　　C ── 孔雀石綠標準工作溶液的濃度，μg/L； </p><p>　　Csi ── 標準工作溶液中內(nèi)

47、標物的濃度，μg/L； </p><p>　　Ci── 樣液中內(nèi)標物的濃度，μg/L；</p><p>　　As ── 孔雀石綠標準工作溶液的峰面積； </p><p>　　A ── 樣液中孔雀石綠的峰面積；</p><p>　　Asi ── 標準工作溶液中內(nèi)標物的峰面積； </p><p>　　Ai ──

48、 樣液中內(nèi)標物的峰面積； </p><p>　　V ── 樣品定容體積，mL； </p><p>　　W ── 樣品稱樣量，g ； </p><p><b>　　3. 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1 UPLC-MS/MS分析</p><p>　　采用電噴霧離子源，正離

49、子掃描模式，分別對MG、LMG和MG-D5、LMG-D6監(jiān)測其母離子和2個信號較強的子離子，以母離子和子離子組成監(jiān)測離子對，以多反應監(jiān)測模式對待測物進行定性和定量分析。在上述儀器分析條件下孔雀石綠、氘代孔雀石綠的參考保留時間分別為1.03min、2.92min。1ng/mL的孔雀石綠和隱色孔雀石綠混合標準溶液的色譜峰如圖1所示。</p><p>　　圖1. 1ng/ml的標準品色譜圖</p><

50、;p>　　Figure 1. 1ng/ml of the standard chromatogram</p><p>　　3.2 標準曲線線性和檢出限</p><p>　　空白魚肉樣品作基質(zhì)，加入最終測定質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20ng/mL的MG和LMG混合標準溶液(相當于樣品中添加0.5、1.0、2.0、4.0、10.0和20.0μg/kg的待測物)，

51、 加入200μL濃度為100ng/mL的混合內(nèi)標標準溶液，按照樣品前處理方法后進行上機測試，試驗結(jié)果以標樣質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標，以MG和LMG的標準峰面積與內(nèi)標MG-D5(LMG-D6)的峰面積之比值為縱坐標制作標準曲線，線性回歸方程和相關系數(shù)見表3。以10倍信噪比計算檢測限，MG、LMG檢出限均為0.5μg/kg，檢測限加標圖譜見圖2、圖3。</p><p>　　圖2. 孔雀石綠標準曲線圖</p

52、><p>　　Figure 2. the standard curve of Malachite green</p><p>　　圖3. 隱色孔雀石綠標準曲線圖</p><p>　　Figure 3. the standard curve of LMG</p><p>　　表3 標準曲線線性回歸方程及相關系數(shù)</p><p

53、>　　Table 3 regression equation of the Standard curve and correlation coefficient</p><p>　　從標準曲線圖和回歸方程及相關系數(shù)可以看出，MG和LMG在0.5—20.0ng/mL的范圍內(nèi)，線性關系良好，線性范圍寬，可很好地用于定量檢測。</p><p>　　圖4. 空白魚肉樣品檢測限（0.5μg/

54、kg）加標色譜圖</p><p>　　Figure 4. Blank fish sample detection limit (0.5μg/kg) spiked chromatogram</p><p>　　從圖4中可以看出，在檢測限加標下，基質(zhì)干擾小，峰形好，色譜響應高，信號與基線噪音的響應比大于10，完全能夠達到0.5μg/kg的檢測限要求。</p><p>　

55、　3.3 回收率與精密度</p><p>　　以草魚、大黃魚和對蝦空白樣品為實驗材料，向空白樣品中添加標準品，添加濃度水平為0.10、0.50、1.00、2.00和4.00 g/kg，然后按照上述方法進行提取、凈化、測定，以內(nèi)標法計算來驗證方法的回收率。方法的回收率和精密度列于表4、表5和表6。</p><p>　　表4 草魚空白樣品中孔雀石綠的加標回收測定結(jié)果</p>&

56、lt;p>　　Table 4 Determination of spike </p><p>　　recovery results of malachite green in the blank sample of Grass carp </p><p>　　表5 大黃魚空白樣品中孔雀石綠的加標回收測定結(jié)果</p><p>　　Table 5 croak

57、er the blank sample of large </p><p>　　yellow spiked recovery of malachite green in the determination of results</p><p>　　表6 對蝦空白樣品中孔雀石綠的加標回收測定結(jié)果</p><p>　　Table 6 the blank sample

58、 of</p><p>　　shrimp spiked recovery of malachite green in the determination of results</p><p>　　從上述結(jié)果可以看出，在0.5—10.0ug/kg加標濃度下，MG和LMG的回收率差別不大，草魚空白樣品添加MG和LMG的平均回收率分別為90.55％—93.02％、89.17%—95.42%；大黃

59、魚空白樣品添加MG和LMG的平均回收率分別為88.73％—92.77％、91.6%—92.22%；對蝦空白樣品添加MG和LMG的平均回收率分別為88.9％—92.83％、86.45%—90.52%，這說明基質(zhì)效應對本實驗的測定結(jié)果影響不大。在不同樣品的不同添加水平下，RSD值均在10％以下，說明本實驗方法精密度好，準確度高。</p><p>　　另每天分別取6份空白草魚和6份空白對蝦樣品分別進行添加水平為0.5μ

60、g/kg、2.0 μg/kg和10.0μg/kg的加標回收率測定，連續(xù)測定三天，計算批間精密度。批間精密度結(jié)果見表7。</p><p><b>　　表7 批間精密度</b></p><p>　　Table 7 precision between Different samples and different time</p><p>　　由

61、實驗結(jié)果可知各添加水平批間相對標準偏差均小于8%，說明該方法用于水產(chǎn)品孔雀石綠的檢測重復性好，精密度和回收率均較高。</p><p><b>　　3.4 色譜圖</b></p><p>　　空白草魚樣品和2.0μg/kg加標樣品后的色譜圖見圖5和圖6所示。</p><p>　　圖5. 草魚空白樣品色譜圖</p><p>

62、　　Figure 5. chromatogram of Carp blank sample</p><p>　　圖6.草魚空白樣品2.0μg/kg加標色譜圖</p><p>　　Figure 6. Chromatogram of Grass carp spiked blank sample 2.0μg/kg</p><p>　　從圖5和圖6可以看出，在2.0μ

63、g/kg的加標下，草魚樣品加標色譜峰形好，基質(zhì)干擾小。</p><p><b>　　4. 討論</b></p><p>　　4.1 方法選擇及改進</p><p>　　目前，國內(nèi)同時檢測MG及其代謝物的標準方法有GB/T 19857-2005和GB/T 20361-2006和SN/T 1768-2006等，但SN/T 1768-2006和GB/

64、T 20361-2006存在檢測方法繁瑣，特別是前處理操作步驟多、耗時較長、費用高及檢測過程使用大量有毒試劑等缺點，因此，筆者采用GB/T19857-2005快速檢測方法進行水產(chǎn)品出口檢測。然而，由于待測物的不穩(wěn)定性，完全采用GB/T19857-2005方法檢測，其MG回收率偏低，而LMG回收率偏高，不能滿足檢測要求。該法在應用GB/T19857-2005檢測方法的基礎上，采用空白樣品添加不同質(zhì)量濃度標準溶液的方式繪制校準曲線，以最大限

65、度排除基體干擾。同時定量方法采用MG-D5和LMG-D6為內(nèi)標進行內(nèi)標法檢測，降低由于前處理過程中目標化合物的損失所帶來的偏差，從而提高定量的準確性，加標回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，整個檢測過程僅需30min左右。</p><p>　　4.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的校準及測定條件優(yōu)化</p><p>　　儀器的狀態(tài)會影響到測定結(jié)果的可靠性。一般情況先采用廠商提供的PPG校準試劑按照特定的方

66、法進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的校準。在每次實驗前采用2.5g/L的標準溶液對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行自校準，以了解其狀態(tài)是否處于正常。 </p><p>　　由于被測物進入質(zhì)譜檢測器時，首先需要離子化，離子化的程度直接影響到分析結(jié)果的靈敏度和準確度，因此，必須先對每一種被測物的質(zhì)譜條件進行全面優(yōu)化。用高濃度(2.0μg/mL )的MG、LMG和內(nèi)標MG-D5、LMG-D6的標準溶液以流動注射的方式在正離子模式下對4

67、種物質(zhì)進行母離子全掃描確定MG、LMG和內(nèi)標MG-D5、LMG-D6的m+1離子分別為m/z 329.2、m/z 331.2、m/z 334.2和m/z 337.2。然后，分別以所得的m/z數(shù)為母離子，對其子離子進行全掃描.從MG及LMG子離子掃描圖中選取2個子離子，從內(nèi)標MG-D5及LMG-D6子離子掃描圖中選取1個子離子，進行多反應監(jiān)測(MRM)，優(yōu)化毛細管電壓、錐孔電壓、二級錐孔電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)，其中以碰撞電壓對離子對的豐

68、度影響最大。接著優(yōu)化脫溶劑氣和錐孔氣等參數(shù)，從而獲得上述測定條件。</p><p>　　4.3 樣品中孔雀石綠提取條件的優(yōu)化</p><p>　　目前報道的水產(chǎn)品中孔雀石綠提取溶劑是單一乙腈溶液、乙腈-乙酸銨混合溶液等。本人比較了乙腈-乙酸銨混合溶液和單一乙腈溶液的提取效率，發(fā)現(xiàn)單一乙腈溶液提取方法操作簡便，且回收率較高，在70%以上，與乙腈-乙酸銨混合溶液的提取效率無顯著差別，因此選用單

69、一乙腈溶液作為提取溶劑。此外，通過在空白草魚樣品中添加了2.00μg/kg的目標化合物來比較不同提取次數(shù)對回收率的影響。分別比較了1次提取、2次提取和3次提取，測定結(jié)果見表8。我們發(fā)現(xiàn)3次提取效果最好，2次提取效果其次，1次提取效率最低。比較3次提取和2次提取的數(shù)值，兩者差別不大，考慮檢測成本和時效性，我們選用2次提取方式。</p><p>　　表8 不同次數(shù)對孔雀石綠和隱色孔雀石綠回收率的影響</p>

70、;<p>　　Table 8 Different times of recovery of the impact of malachite green and LMG</p><p>　　4.4 魚肉樣品的保存</p><p>　　由于孔雀石綠容易分解，因此，樣品的儲存條件對檢測結(jié)果有一定的影響。比較了添加濃度為2.00μg/kg的 草魚樣品在4℃和-18℃兩種不同保存溫度

71、條件下，不同保存天數(shù)對孔雀石綠和隱色孔雀石綠回收率的影響效果。測定結(jié)果見表9。</p><p>　　表9 不同樣品保存條件下孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率(n=3)</p><p>　　Table 9 different samples under storage </p><p>　　conditions of malachite green and leuco

72、 malachite green recovery (n = 3)</p><p>　　從表9中可以看出，在不同保存溫度下，不同的保存天數(shù)對孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率影響非常大。在4℃保存條件下，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率隨著保存天數(shù)的延長而顯著下降；而在-18％保存條件下，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率隨著保存天數(shù)的延長并未呈現(xiàn)出顯著下降現(xiàn)象。這說明了孔雀石綠和隱色孔雀石綠在4℃下是非常不穩(wěn)定的。因此，

73、樣品應保存在-18℃以下。</p><p>　　4.5 樣品溶液放置時間對檢測結(jié)果的影響</p><p>　　由于MG及其代謝物的不穩(wěn)定性，文章研究了樣品溶液放置時間對檢測結(jié)果的影響。研究比較了2種待測物平均添加水平為3.0μg/kg的魚肉樣品處理完后在10℃下避光放置0、30、60min及6h、12 h檢測對回收率的影響。結(jié)果顯示，MG在研究時間內(nèi)對放置時間影響較小，而LMG回收率隨著放

74、置時間的延長而呈下降趨勢。與樣品處理好后及時上機相比，LMG在放置30、60 min及6、12 h后檢測的回收率分別下降了13％ 、24％ 、30％ 和34％，因此，為了保證檢測數(shù)據(jù)準確可靠，樣品前處理時間不宜太長，樣品處理完后應及時上機檢測，可考慮對標準工作溶液和樣品溶液進行穿插進樣檢測，特別是檢測隱色代謝物。同時為了保證檢測數(shù)據(jù)準確可靠，檢測過程也應注意以下事項：1)整個檢測過程要盡量避光，防止待測物降解；2)標準貯備液應在-18℃

75、以下避光保存，有效期3個月，混合標準工作溶液應現(xiàn)配現(xiàn)用；3)檢測過程避免交叉污染，包括樣品之間、樣品與標準溶液之間等。</p><p><b>　　5. 小結(jié)</b></p><p>　　超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是痕量分析中分離鑒定熱不穩(wěn)定化合物的強有力工具。本實驗建立的方法中，采用陽離子交換柱和同位素內(nèi)標法定量，有效消除了基質(zhì)效應帶來的影響。所建立的方法能同時分離

76、鑒定水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠殘留，且重復性和準確性好，檢出限為0.10μg/kg，優(yōu)于現(xiàn)行有效的方法檢出限，大大縮短了檢測時間，減少了有機溶劑用量，是水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠殘留總量快速而準確的檢測方法，該方法完全滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留檢出的要求。</p><p><b>　　[參 考 文 獻]</b></p><p>　　[1] 劉海新

77、等.水產(chǎn)品中孔雀石綠檢測方法研究進展[J].福建水產(chǎn)，2007．</p><p>　　[2] 翟毓秀，郭瑩瑩，耿霞，等.孔雀石綠代謝機理及生物毒性研究進展口].中國海洋大學學報，2007．</p><p>　　[3] 邱緒建，林洪，王聯(lián)珠，等．孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠在鯽魚肌肉中的代謝[J].中國海洋大學學報，2006．</p><p>　　[4] 曲志娜等

78、.孔雀石綠及其代謝物在大菱蚌肌肉中的消除規(guī)律，2008．</p><p>　　[5] 高露姣，蔡友瓊，姜朝軍，等.孔雀石綠及其主要代謝產(chǎn)物在歐洲鰻鱺肌肉中蓄積及消除規(guī)律[J].水產(chǎn)學報，2007．</p><p>　　[6] 揚先樂，喻文娟，王民權(quán)，等.對孔雀石綠的禁用及思考[J].水產(chǎn)科技情報，2005．</p><p>　　[7] 龔朋飛，王權(quán)，陳永軍，等.孔雀

79、石綠毒性及其檢測研究進展FJ1.水利漁業(yè)，2007．</p><p>　　[8] 周立缸等．用微棱技術(shù)研究孔雀石綠對魚的謗變作用[J].集美大學學報，1997.</p><p>　　[9] 郭德華，葉長淋，李波，等.高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠及代謝產(chǎn)物[J].分析測試學報，2004，23.</p><p>　　[10] GB/T19857-2005.水

80、產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定的國家標準[S].</p><p>　　[11] 張海琪，何中央，鄭重鶯，等．液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠的殘留量[J].南方水產(chǎn)，2007，3(6)：14—21．</p><p>　　[12] 謝文，丁慧瑛，奚君陽，等．水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物殘留量的檢測[J]．色譜，2006，24(5)：529—530．</p>

81、<p>　　[13] 張玉黔，權(quán)伍英，欒燕，等．液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱性孔雀石綠的方法研究[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16 (7)：826—827．</p><p>　　[14] 劉軍，胡華軍，張明洲，等．漁藥孔雀石綠的毒性、危害和檢測現(xiàn)狀[J]．浙江農(nóng)業(yè)學報，2006，18(5)：397—340．</p><p>　　[15] 翟毓秀，郭

82、瑩瑩，耿霞，等．孔雀石綠的代謝機理及生物毒性研究進展[J]．中國海洋大學學報，2007，37(1)：27—32．</p><p>　　[16] 盧邁新，黃樟翰，肖學錚，等．美洲鰻對幾種藥物的敏感性研究[J]．淡水漁業(yè)，2000，30(5):28—29．</p><p>　　[17] 王學亮，孫偉，焦奎，等. 以溴甲酚紫為電化學探針測定血清白蛋白[J]. 高等學?；瘜W學報，2004，25(8

83、):1448.</p><p>　　[18] 韓英強，羅登柏，藍金貴，等. 血清蛋白2熒光素復合物單掃極譜波與應用[J].分析科學學報，2003，19 (2):113.</p><p>　　[19] 高峰，朱昌青，汪樂余，等.燦爛甲酚藍與表面活性劑的作用及其在蛋白質(zhì)測定中的應用[J].分析化學，2002，30(3):324.</p><p>　　[20] 王明俊.獸

84、醫(yī)生物制品學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1997:344.</p><p>　　[21] 郭德華，葉長淋，朱瑩潔，等.液相色譜法測定鰻魚中的孔雀石綠[J].化學分析計量， 2002，11(2):20.</p><p>　　[22] 劉桂華，姜杰，謝建濱.同位素素內(nèi)標稀釋高效液相色譜-質(zhì)譜法測定魚體中的孔雀石綠及其代謝物[J]，現(xiàn)代預防醫(yī)學，2006年01期.</p><

85、;p>　　[23] 鐘仕花，周娟.平行蒸發(fā)儀-孔雀石綠回收實驗.《中國科技博覽》2010年第25期.</p><p>　　[24] 馬瑞欣，孫偉彬，郎玉苗.養(yǎng)殖用水中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物的測定《河北漁業(yè)》2010年第6期.</p><p>　　[25] 歐志明，武平，羅國武.孔雀石綠在幾種魚體殘留量變化的研究.《水產(chǎn)科技》2010年第1期.</p><p&g

86、t;　　[26] 劉國信.孔雀石綠拉響食魚安全警報.《食品與健康》2005年第12期.</p><p>　　[27] 李永生，劉艷輝.禁用藥物孔雀石綠的毒性、危害及控制措施.《吉林水利》2010年第5期.</p><p>　　[28]梁高道，麥琦.氣相色譜質(zhì)譜法確認水產(chǎn)品中的孔雀石綠.《公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學》2009年第6期.</p><p>　　[29] 那廣水，李

87、紅霞，周傳光，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定海水中孔雀石綠及其代謝物.《海洋環(huán)境科學》2008年第A02期.</p><p>　　[30] Aldert AB,Peter S cherpeni sse. Determinat ion of res idues of malachit e green in aquatic animals [J].J Chromatogr B，2003，788(12):351.&l

88、t;/p><p>　　[31] TURNIPSEED SB，ROYBAL JE，HURLBUT JA，et a1.Gaschromatographic/mass spectr- ometric confirmation of leuco malachitegreen in catfish(Ictalurus punctat- us)tissue[J]．JAOAC Int，1995，78 (4):971—977.<

89、;/p><p>　　[32] SR1VASTAVAS，SINHAR，ROYD.Toxicological efects of mala-chite gerbil[J]．Aquat Toxicol，2004，66(3)：319—329．</p><p>　　[33] BOSEB，MOTIWALEL，RAOKVK．DNA damage and G2/M atrest in Syrian hams