一株高致病性雞傳染性貧血病毒的生物學(xué)及基因組特性.pdf

1、雞傳染性貧血病毒(Chicken anernia virus，CAV)在世界主要養(yǎng)禽國(guó)家廣泛分布，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病原體之一。CAV感染可以破壞造血系統(tǒng)，并可使淋巴器官萎縮，導(dǎo)致雞群免疫抑制，這又經(jīng)常使感染雞群并發(fā)或繼發(fā)其它病原體的多重感染，導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此對(duì)CAV的系統(tǒng)研究甚為重要，本研究是從CAV的檢測(cè)方法、流行情況以及流行毒株的基因變異和致病性進(jìn)行系統(tǒng)的研究。 根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的CAV VP1基因的序列

2、，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增CAV VP1基因的的核酸片段，利用非放射性標(biāo)記物地高辛(DIG)，通過(guò)PCR方法制備了CAV核酸探針。通過(guò)斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法對(duì)此探針特異性及靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證，特異性檢測(cè)結(jié)果表明，該探針能與標(biāo)準(zhǔn)模式株CAV核酸發(fā)生特異性雜交，而與對(duì)照的SPF雞、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、馬立克氏病病毒(MDV)、呼腸孤病毒(REOV)核酸雜交反應(yīng)為陰性，具有較強(qiáng)的特異性。敏感性檢測(cè)結(jié)果表明，該探針對(duì)CAV的最

3、低檢出量為1 pg核酸，具有較高的靈敏度，顯示所制備的核酸探針用于臨床病料組織DNA中CAV感染的檢測(cè)是可行的。 本實(shí)驗(yàn)收集山東泰安、臨沂、萊蕪、煙臺(tái)等8市3個(gè)品系、不同日齡發(fā)病雞群的384只病、死雞的脾臟樣品，其中麻雞105份、肉雞185份、蛋雞94份，通過(guò)斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)樣品中的CAV核酸，檢測(cè)結(jié)果為，CAV總檢出率為27.9％(107/384)。3個(gè)品系的雞的檢測(cè)結(jié)果：麻雞樣品的檢出率為37.1％(39/105)；肉雞樣品

4、的檢出率為31.3％(58/185)；蛋雞樣品的檢出率11.7％(11/94)。結(jié)果顯示，麻雞和肉雞中CAV感染的檢出率顯著高于蛋雞。3個(gè)不同日齡段的檢測(cè)結(jié)果：1-20日齡的樣品檢出率為6.4％(7/110)；20-60日齡的樣品檢出率為45.6％(93～04)；60日齡以上的樣品檢出率為10.0％(7/70)。結(jié)果顯示，20-60日齡的檢出率顯著高于1-20日齡和60日齡以上的，而20-60日齡段是疾病的高發(fā)階段。 其中，從自

5、山東某商品代肉雞場(chǎng)20日齡病雞群表現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩，疑似雞傳染性貧血病病毒(CAV)感染的脾臟、胸腺、骨髓樣品提取DNA，分別經(jīng)斑點(diǎn)雜交檢測(cè)為CAV陽(yáng)性后，其余病料研磨上清經(jīng)處理后接種7日齡SPF雞胚和1日齡SPF雞，提取接種后的雞胚和SPF雞的脾臟組織DNA，經(jīng)斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證為陽(yáng)性，從而成功分離到了一株雞傳染性貧血病毒野毒株，命名為CAV-SDLX08株。用PCR方法分段擴(kuò)增出CAV-SDLY08基因組的三條部分重疊片段，分別克隆于T載體并進(jìn)

6、行測(cè)序，拼接后得到其全基因組序列。結(jié)果表明，SDLY08株基因組全長(zhǎng)2298nt，含有三個(gè)互相重疊的開(kāi)放閱讀框和一個(gè)調(diào)控區(qū)。將SDLY08全基因與已發(fā)表的8個(gè)CAV分離株基因組比較，同源性為96.6％-99.0％。CAV的三個(gè)編碼基因VP1、VP2和VP3所編碼的氨基酸均有一定程度變異，以VP1基因編碼的氨基酸變異性最大，同源性為96.9％-99.0％ 將CAV-SDLY08株接種感染1、7、21日齡SPF雞，研究其致病性。通過(guò)

7、口服和肌肉注射兩種途徑分別感染1、7、21日齡SPF雞，12天后對(duì)每組SPF雞體重、免疫器官指數(shù)和血液指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。 體重增重方面：感染12天后，1、7日齡感染組的體重顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而兩不同途徑感染組間的差異不顯著(P>0.05)。21日齡感染組體增重也低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)，兩種感染方式的差異也不顯著。 免疫器官指數(shù)方面：感染12天后，不同日齡的感染均能引起脾臟的腫大，1日齡感染的口

8、服組和注射組與對(duì)照組比差異顯著(P<0.05)。7日齡和21日齡的與對(duì)照組比，差異不顯著(P>0.05)，且感染途徑影響不大。3個(gè)日齡感染都能引起胸腺的顯著萎縮，且不同的感染日齡和感染方式的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異都極顯著(P<0.01)。 血液指標(biāo)方面：感染12天后，可引起白細(xì)胞數(shù)量的減少，1日齡感染的口服組和注射組與對(duì)照比差異極顯著(P<0.01)。7日齡和21日齡，注射組顯著低于口服組和對(duì)照組(P<0.05)，口服組和對(duì)照組

9、差異不顯著(P>0.05)。與對(duì)照組相比，CAV感染都能引起紅細(xì)胞數(shù)量的顯著減少(P<0.01)，口服組和注射組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，且兩種感染方式之間差異顯著(P<0.05)。與對(duì)照組相比，都能引起紅細(xì)胞壓積的顯著減少(P<0.01)，1日齡和7日齡感染的口服組和注射組差異極顯著(P<0.01)，21日齡差異顯著(P<0.05)。 綜合結(jié)果顯示，CAV-SDLY08株感染三個(gè)日齡SPF雞12天后，均可導(dǎo)致增重