大豆異黃酮與玉米赤霉烯酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7聯(lián)合作用的研究.pdf

1、玉米赤霉烯酮(zearealenone,ZEA)是我國(guó)飼料中污染比較嚴(yán)重的一種霉菌毒素,具有雌激素活性,對(duì)動(dòng)物的繁殖性能構(gòu)成巨大的危害。大豆異黃酮(soybeanisoflavone,SIF)主要存在于豆科植物的莢豆類(lèi),以大豆中含量較高,也具有輕度雌激素作用,能夠與動(dòng)物雌激素受體結(jié)合,當(dāng)體內(nèi)雌激素水平較低時(shí)可以表現(xiàn)出雌激素活性而當(dāng)異黃酮濃度較高時(shí)則表現(xiàn)為抗雌激素活性,具有雙向調(diào)節(jié)平衡功能。富含大豆異黃酮的豆粕等大豆制品是重要的蛋白質(zhì)補(bǔ)充

2、飼料,而玉米赤霉烯酮在配合飼料中污染十分普遍,因此,ZEA與GEN在配合飼料中常常共存,存在著對(duì)動(dòng)物的聯(lián)合作用。本課題以雌激素受體陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對(duì)象,研究ZEA和GEN聯(lián)合作用對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響,并揭示其作用的可能機(jī)制。
　　 將ZEA、GEN和E2用無(wú)水乙醇溶解,用無(wú)酚紅DMEM(含5％CDT-FBS)培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。試驗(yàn)共分10個(gè)組,分別為:(1)溶劑對(duì)照組；(2)陽(yáng)性對(duì)照

3、組:8nmol/LE2；(3)處理1:10nmol/L ZEA；(4)處理2:20nmol/LZEA；(5)處理3:16μmol/LGEN;(6)處理4:32μmol/LGEN;(7)處理5:10nmol/LZEA+16μmol/LGEN；(8)處理6:10nmol/LZEA+32μmol/LGEN；(9)處理7:20nmol/LZEA+16μmol/LGEN；(10)處理8:20nmol/LZEA+32μmol/LGEN。通過(guò)流式細(xì)胞

4、儀在448nm波長(zhǎng)下進(jìn)行細(xì)胞DNA含量和細(xì)胞周期分布百分比分析；MTT比色試驗(yàn),觀(guān)察各處理對(duì)細(xì)胞增殖的影響；采用RT-PCR和Western印跡法定量檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白E1(CyclinE1)、細(xì)胞周期蛋白激酶2(CDK2)、死亡抑制基因(bcl-2)與死亡誘發(fā)基因(bax)mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)表達(dá)豐度,采用RT-PCR檢測(cè)雌激素受體(estrogen receptor,ER)mRNA表達(dá)豐度,并通過(guò)Giemsa染色法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)判定各處

5、理對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 試驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.對(duì)細(xì)胞增殖的影響:同溶劑對(duì)照組相比,ZEA在較低濃度條件下(10nmol/L,72h)就能促進(jìn)MCF－7細(xì)胞增殖(p<0.05),32μmol/L GEN對(duì)MCF-7細(xì)胞處理24h可明顯抑制MCF－7細(xì)胞增殖(p<0.05)。同處理1、處理2相比,處理5、處理6、處理7、處理8中,16μmol/L、32μmol/L GEN可顯著降低10nmol/L、20nmol/LZEA

6、處理24h、48h、72h引起的MCF－7細(xì)胞增殖(p<0.05)。
　　 2.對(duì)細(xì)胞周期的影響:同溶劑對(duì)照組相比,處理3、處理4 S期細(xì)胞比例顯著減少(p<0.05),陽(yáng)性對(duì)照組、處理1、處理2顯著增加了MCF－7細(xì)胞S期的分布(p<0.05)。同溶劑對(duì)照組相比,處理5、處理6、處理7、處理8中,16μmol/L、32μmol/L GEN可顯著降低10nmol/L、20nmol/L ZEA引起的S期細(xì)胞比例增加(p<0.05)

7、,同時(shí)顯著的增加了G2/M期的細(xì)胞比例(p<0.05)。
　　 3.對(duì)ERα、ERβ mRNA表達(dá)影響:同溶劑對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組,處理2顯著的上調(diào)了MCF-7細(xì)胞ERα、ERβ mRNA表達(dá)豐度(p<0.05),處理4顯著下調(diào)了MCF-7細(xì)胞ERa、ERβ mRNA表達(dá)豐度(p<0.05)。同處理1、處理2相比,處理5、處理6、處理7、處理8顯著下調(diào)了MCF一7細(xì)胞ERa、ER[3 mRNA表達(dá)豐度(p<0.05)。

8、　　 4.對(duì)bcl-2、bax mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)影響:同溶劑對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和處理1、處理2均可明顯上調(diào)bcl-2,下調(diào)bax的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(P<0.05),但是,處理4、處理5卻明顯下調(diào)bcl-2,上調(diào)bax的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(p<0.05)。同處理1、處理2相比,處理5、處理6、處理7、處理8顯著下調(diào)了bcl-2,同時(shí)上調(diào)了bax mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(p<0.05)。
　　 5.對(duì)CDK2、C

9、yclinE1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)影響:同溶劑對(duì)照組相比,處理1、處理2可明顯上調(diào)CDK2和CyclinE1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(p<0.05),但是,處理3、處理4明顯下調(diào)CDK2和CyclinE1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(p<0.05)。同處理1、處理2相比,處理5、處理6、處理7、處理8顯著下調(diào)了CDK2和CyclinE1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)(p<0.05)。
　　 6.對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:Giemsa染色顯示溶劑

10、對(duì)照組、處理3、處理4、處理5、處理6、處理7、處理8,能夠抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng),促使其凋亡,而陽(yáng)性對(duì)照組、處理1、處理2中MCF-7細(xì)胞則未見(jiàn)有深染的凋亡細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.16μmol/L、32μmol/L的GEN能夠抑制10nmol/L、20nmol/L ZEA誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞增殖。
　　 2.16μmol/L、32μmol/L的GEN能夠下調(diào)MCF-7細(xì)胞bcl-2、CyclinE1以及