奶牛乳腺上皮細(xì)胞葡萄糖攝取的調(diào)控及其對(duì)乳成分合成的影響研究.pdf

1、葡萄糖是乳汁合成的主要前體物質(zhì)之一，與乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)密切相關(guān)。本研究圍繞奶牛乳腺上皮細(xì)胞葡萄糖攝取的調(diào)控及其對(duì)乳成分合成的影響展開(kāi)了以下研究：首先建立了泌乳奶牛乳腺上皮細(xì)胞模型；其次分別研究了泌乳相關(guān)激素和單糖基質(zhì)對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)和葡萄糖攝取的影響；最后探討了葡萄糖供應(yīng)量對(duì)主要乳成分(乳脂和乳糖)合成的影響及其可能機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.泌乳奶牛乳腺上皮細(xì)胞模型建立及其功能檢測(cè)
　　 該部分旨在建立奶

2、牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳模型。試驗(yàn)選擇DMEM/F-12培養(yǎng)液，用組織塊培養(yǎng)法得到奶牛乳腺上皮細(xì)胞。為維持乳腺細(xì)胞的泌乳功能，在培養(yǎng)體系中添加了催乳素、胰島素、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白等成分。根據(jù)乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰酶敏感度的不同，采用0.25％胰酶和0.15％胰酶加0.02％EDTA反復(fù)酶差消化，得到較為純化的乳腺上皮樣細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞呈單層、鵝卵石樣鋪展，可形成腺泡和島嶼狀結(jié)構(gòu)，具有上皮細(xì)胞的典型形態(tài)特征。此外，通過(guò)乳腺上皮細(xì)胞特征性細(xì)

3、胞角蛋白18免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析，證明培養(yǎng)得到的細(xì)胞是正常乳腺上皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞傳至第10代，細(xì)胞依然生長(zhǎng)旺盛。通過(guò)細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)觀察、乳脂形態(tài)觀察、αs1酪蛋白基因表達(dá)、酪蛋白Western-blot含量檢測(cè)等方法檢測(cè)乳腺細(xì)胞的泌乳功能，證明培養(yǎng)至第10代的乳腺上皮細(xì)胞仍具有乳汁合成和分泌功能，表明本研究建立的奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)模型可作為乳腺生理相關(guān)功能研究的模型。
　　 2.泌乳相關(guān)激素對(duì)乳腺細(xì)胞主要葡萄

4、糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響及相關(guān)信號(hào)通路研究
　　 該部分研究了泌乳相關(guān)激素(催乳素、胰島素和氫化可的松)單獨(dú)及組合作用對(duì)GLUT1和GLUT8基因表達(dá)的影響，探討了胰島素調(diào)控GLUT8基因表達(dá)和葡萄糖攝取的相關(guān)信號(hào)通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度催乳素和胰島素對(duì)GLUT1基因表達(dá)均無(wú)顯著影響(P>0.05)，高劑量催乳素可顯著降低GLUT8基因表達(dá)(P<0.05)；添加胰島素可促進(jìn)GLUT8基因表達(dá)(P<0.05)；隨著氫化可的松濃度增

5、加，GLUT1和GLUT8基因表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。同時(shí)添加胰島素(5ng/mL)和氫化可的松，發(fā)現(xiàn)胰島素和氫化可的松有明顯的交互作用(P<0.01)，氫化可的松可拮抗胰島素提高GLUT8基因表達(dá)的作用；同時(shí)添加3種激素時(shí)，GLUT1和GLUT8基因表達(dá)與單獨(dú)添加氫化可的松趨勢(shì)一致。
　　 其次，利用胰島素相關(guān)信號(hào)通路PI3K、MAPK和PKC的抑制劑和激動(dòng)劑，研究了胰島素調(diào)控GLUT8基因表達(dá)和葡萄糖攝取的分子機(jī)理。研

6、究發(fā)現(xiàn)。抑制MAPK對(duì)乳腺細(xì)胞葡萄糖攝取無(wú)顯著影響(P>0.05)，抑制PI3K可顯著降低胰島素促進(jìn)的葡萄糖攝取和GLUT8基因表達(dá)(P<0.05)，提示胰島素可能主要通過(guò)PI3K通路參與調(diào)控葡萄糖攝??；進(jìn)一步研究PI3K的下游信號(hào)分子PKC發(fā)現(xiàn)，激活PKC可顯著提高GLUT1、GLUT8基因表達(dá)和乳腺細(xì)胞葡萄糖攝取(P<0.05)，抑制PKC可顯著降低PKC激活所促進(jìn)的GLUT1、GLUT8基因表達(dá)和葡萄糖攝取(P<0.05)。上述研

7、究結(jié)果提示，GLUT1和GLUT8基因表達(dá)分別受不同泌乳相關(guān)激素的調(diào)控，胰島素可能主要通過(guò)PI3K/PKC通路促進(jìn)GLUT8表達(dá)和葡萄糖攝取。
　　 3.單糖基質(zhì)和葡萄糖濃度對(duì)乳腺細(xì)胞糖攝取的調(diào)控及其機(jī)理研究
　　 該部分研究了不同類型單糖基質(zhì)(葡萄糖或果糖)對(duì)乳腺細(xì)胞的影響以及葡萄糖濃度調(diào)控乳腺葡萄糖攝取的分子機(jī)制。首先，研究了葡萄糖或果糖對(duì)乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)、糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖或果糖組乳腺細(xì)胞活力均高

8、于無(wú)糖組(P<0.05)；糖濃度相同時(shí)，果糖組的細(xì)胞活力顯著高于葡萄糖組(P<0.05)；隨著葡萄糖或果糖濃度的增加，乳腺細(xì)胞活力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而糖攝取量顯著升高(P<0.05)。上述研究結(jié)果提示，奶牛乳腺上皮細(xì)胞可以利用果糖，其轉(zhuǎn)運(yùn)和利用效率可能高于葡萄糖。
　　 其次，研究葡萄糖濃度對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體和己糖激酶的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理12 h時(shí)，與對(duì)照組(2.5 mmol/L)相比，5或10 mmol/L葡萄糖不影響

9、GLUT1 mRNA豐度(P>0.05)，而20 mmol/L葡萄糖可顯著降低GLUT1基因表達(dá)(P<0.05)，高濃度葡萄糖組(5、10和20 mmol/L)的己糖激酶酶活均高于對(duì)照組(P<0.05)，而不同葡萄糖濃度對(duì)GLUT8和HK2的mRNA豐度均無(wú)顯著影響(P>0.05)；處理24時(shí)，GLUT1、GLUT8和HK2基因表達(dá)均隨著葡萄糖濃度的增加而降低(P<0.05)；添加HK2抑制劑三-溴丙酮酸(3-BrPA)可顯著降低2.5

10、和10 mmol/L葡萄糖組的葡萄糖攝取和細(xì)胞活力(P<0.05)。研究結(jié)果提示，葡萄糖濃度可能部分通過(guò)提高HKs酶活調(diào)控乳腺細(xì)胞葡萄糖攝取，而HK2在此過(guò)程中起重要作用。
　　 4.葡萄糖濃度對(duì)乳腺細(xì)胞主要乳成分合成和葡萄糖代謝的影響
　　 該部分研究了葡萄糖供應(yīng)對(duì)奶牛乳腺細(xì)胞主要乳成分合成和葡萄糖代謝的影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度葡萄糖(5、10或20 mmol/L)可影響乳脂合成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)，處理12時(shí)，與5 mm

11、ol/L葡萄糖組相比，增加葡萄糖濃度對(duì)乙酰CoA羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)和三磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)的基因表達(dá)量均無(wú)顯著影響(P>005)；處理24和48 h時(shí)，ACC、FAS、DGAT和GPAT的基因表達(dá)量隨葡萄糖濃度的增加而降低(P<005)，但均高于相同葡萄糖濃度處理12 h組。其次，研究當(dāng)葡萄糖供應(yīng)充足時(shí)(處理12 h)葡萄糖濃度對(duì)乳脂含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺細(xì)胞甘油三酯含

12、量隨葡萄糖濃度的增加而增加，其中10和20 mmol/L組顯著高于2.5mmol/L組(P<005)。
　　 不同濃度葡萄糖處理12 h對(duì)乳糖合成、糖酵解和磷酸戊糖途徑的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(2.5 mmol/L)相比，高濃度葡萄糖(5和10 mmol/L)可顯著提高β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(B4GALT)的基因表達(dá)量(P<005)；不同濃度葡萄糖不影響乳清蛋白(LA)基因表達(dá)量(P>005)；10和20 mmol/L葡萄

13、糖可顯著提高乳糖合成酶蛋白含量(P<005)；10 mmol/L組丙酮酸激酶和葡萄糖6磷酸脫氫酶活力均顯著高于2.5 mmol/L組；高濃度葡萄糖組(10 mmol/L)的線粒體勢(shì)能和細(xì)胞ATP含量均高于低濃度葡萄糖組(2.5 mmol/L)(P<005)。上述研究結(jié)果提示，增加葡萄糖供應(yīng)可能增加了乳糖合成底物濃度，促進(jìn)乳糖合成，促進(jìn)葡萄糖酵解和磷酸戊糖途徑的代謝，增加細(xì)胞能量產(chǎn)出，進(jìn)而提高乳腺乳脂合成量。
　　 綜上所述，本研