奶牛乳腺上皮細胞的分離鑒定及DBP誘導β-酪蛋白的分泌研究.pdf

1、乳腺生物反應器充分利用動物乳腺組織具有合成和分泌乳汁的功能，目前被廣泛使用于生產(chǎn)功能蛋白等，現(xiàn)已成為極具開發(fā)應用前景的生物技術(shù)。乳腺上皮細胞是乳腺組織中特異性具有分泌功能的細胞，在體外分離培養(yǎng)的乳腺上皮細胞同樣擁有與在體內(nèi)組織相似的分泌功能，建立乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)為研究乳腺組織的泌乳機理、驗證和檢測乳腺特異表達載體功能具有重要意義。
　　本研究對牛乳腺上皮細胞進行分離、培養(yǎng)和鑒定，并用鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)誘導體外培養(yǎng)的

2、乳腺上皮細胞表達β-酪蛋白。論文的研究內(nèi)容主要包括兩個部分:
　　1.利用泌乳期的奶牛乳腺組織，在體外進行乳腺上皮細胞的分離、純化和鑒定。本研究利用組織塊培養(yǎng)法、酶消化培養(yǎng)法、機械培養(yǎng)法進行分離細胞，利用差速貼壁結(jié)合差速脫壁純化分離的乳腺上皮細胞。對分離細胞的顯微觀察表明，三種方法培養(yǎng)細胞可以獲得成纖維樣細胞和上皮樣細胞混合生長的細胞，培養(yǎng)細胞形態(tài)完整;差速脫壁法和差速貼壁法結(jié)合純化細胞，成纖維樣細胞完全消失，所得細胞全部為為鵝卵

3、石狀或卵圓形的上皮樣細胞。純化的細胞傳代培養(yǎng)，細胞進行顯微觀察、生長曲線繪制、核型制備，結(jié)果表明培養(yǎng)的細胞形態(tài)良好、具有正常的上皮細胞形態(tài)、細胞生長正常并且核型完整、有正常的染色體數(shù)目。應用免疫熒光方法鑒定乳腺上皮細胞特異表達的角蛋白5、角蛋白8和角蛋白18的表達情況，研究表明，純化的細胞表達特異性角蛋白5、8、18并且其表達率達到90％。PCR檢測牛乳腺上皮細胞β-casein在mRNA水平的表達，結(jié)果表明，所培養(yǎng)的細胞能夠轉(zhuǎn)錄表達β

4、-酪蛋白。
　　2.研究DBP對乳腺上皮細胞β-酪蛋白分泌誘導作用。β-酪蛋白是乳腺中高表達的乳蛋白成分，本實驗中利用中草藥王不留行的活性單體DBP來誘導乳腺上皮細胞β-酪蛋白的表達，以添加胰島素、氫化可的松、胰島素樣生長因子、催乳素的無血清培養(yǎng)液為對照的誘導液組。首先分別用0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/m

5、l濃度的DBP處理液培養(yǎng)細胞。MTT比色檢測結(jié)果表明0.4-0.8(mg/ml)濃度時細胞增殖明顯。細胞經(jīng)0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml DBP誘導液和對照組誘導液培養(yǎng)，顯微觀察細胞形態(tài)、流式細胞儀檢測誘導液對細胞的活率的影響，結(jié)果表明細胞生長狀態(tài)良好，均無明顯差異。牛乳腺上皮細胞經(jīng)不同誘導液誘導培養(yǎng)，應用實時熒光定量PCR檢測細胞β-酪蛋白在mRNA水平的表達，結(jié)果表明，經(jīng)0.5 mg/ml的DBP誘導液培養(yǎng)的牛