卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中卵丘細(xì)胞上基因表達(dá)譜變化及其生物學(xué)意義.pdf

1、卵泡作為卵巢的功能單位，由卵母細(xì)胞及包裹于其周?chē)念w粒細(xì)胞(granulosacells，GCs)和外圍的膜細(xì)胞組成。卵泡生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而又精細(xì)調(diào)控的過(guò)程，期間卵母細(xì)胞逐步獲得發(fā)育潛能，為后續(xù)受精及胚胎發(fā)育做準(zhǔn)備。卵泡發(fā)育過(guò)程中，隨著卵泡腔形成，顆粒細(xì)胞分化為兩種不同表型:①壁顆粒細(xì)胞(Muralgranulose cells，MGCs)，位于卵泡腔周?chē)?，主要功能為?lèi)固醇激素合成及促進(jìn)卵泡壁破裂;②卵丘細(xì)胞(cumulus cell

2、s，CCs)，與卵母細(xì)胞緊密聯(lián)系，兩者構(gòu)成卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體(COC)。卵母細(xì)胞和CCs之間通過(guò)縫隙鏈接和旁分泌信號(hào)通路相互交流，形成卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境，并貫穿于整個(gè)卵泡發(fā)育過(guò)程。在竇前卵泡階段，卵泡生長(zhǎng)不依賴(lài)于FSH的作用，主要通過(guò)GCs上表達(dá)KIT配體(KITL)，作用于卵母細(xì)胞上的受體KIT促進(jìn)卵子生長(zhǎng);反過(guò)來(lái)，卵子通過(guò)旁分泌因子(oocyte secrete factors，OSFs)，主要為生長(zhǎng)分化因子9(GDF9

3、)和骨形態(tài)形成蛋白15(BMP15)，作用于CCs促進(jìn)CCs增殖、抗凋亡。在竇卵泡階段，CCs通過(guò)縫隙連接向卵子傳遞cAMP和cGMP等小分子物質(zhì)以維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯，同時(shí)其自身也受到OSFs的調(diào)節(jié)以拮抗FSH引起的黃素化作用;在卵母細(xì)胞成熟階段，卵母細(xì)胞和CCs相互協(xié)調(diào)完成卵丘擴(kuò)張及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)。此外，CCs為卵母細(xì)胞提供必須的代謝小分子如丙酮酸、丙氨酸和膽固醇以供卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)卵母細(xì)胞促進(jìn)了CCs三大代謝相關(guān)酶

4、的表達(dá)。卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞這些緊密的相互作用，提示卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中在CCs上存在諸多印記，即CCs上的相關(guān)基因表達(dá)、分子和信號(hào)可以間接反應(yīng)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的狀態(tài)。
　　卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)(IVM)指將未成熟卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(GV-COCs)從竇卵泡中取出，在特定的體外培養(yǎng)體系中培養(yǎng)成熟(MⅡ-COCs)。IVM作為一項(xiàng)輔助生殖前沿技術(shù)，尤其適用于卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)患者及多囊卵巢綜合征(PCOS)患者。此外，近年來(lái)

5、也有學(xué)者提出，在一些激素敏感性腫瘤患者治療前可應(yīng)用IVM對(duì)其行生育力保存。但是大量的臨床數(shù)據(jù)表明，和體內(nèi)成熟卵子相比，IVM后的卵子發(fā)育潛能低，因此，IVM尚未廣泛應(yīng)用于臨床。探索IVM過(guò)程中卵丘細(xì)胞的狀態(tài)及相關(guān)基因表達(dá)有助于深入理解卵母細(xì)胞成熟機(jī)制并有望改進(jìn)IVM培養(yǎng)體系。小鼠COC體外培養(yǎng)和IVM，是此類(lèi)研究的最常用模型。
　　近年來(lái)，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)GCs或CCs上基因表達(dá)譜成為可能。已見(jiàn)研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)及q-

6、PCR技術(shù)嘗試分析CCs與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)的生物標(biāo)記物;也有研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)確定了不同培養(yǎng)條件下CCs上的基因表達(dá)譜差異。然而，鮮有關(guān)于IVM過(guò)程中CCs上基因表達(dá)譜變化的研究。因此，我們認(rèn)為，基于卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的相互交流理論，IVM過(guò)程中CCs上的基因表達(dá)譜發(fā)生一系列的變化，通過(guò)高通量技術(shù)可以獲得表達(dá)譜的變化，可望從中篩選出某些因子作為生物標(biāo)記物間接評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。
　　為了驗(yàn)證以上科研假說(shuō)，深入理解卵母細(xì)胞與

7、CCs之間的相互交流及卵母細(xì)胞成熟的分子機(jī)制，本研究以小鼠IVM及IVF為模型，應(yīng)用高通量技術(shù)研究CCs上基因表達(dá)譜特征，確定CCs上卵母細(xì)胞胞核及胞質(zhì)發(fā)育潛能相關(guān)生物標(biāo)記物，以期無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量。作為該研究的一部分，本文應(yīng)用小鼠IVM模型通過(guò)基因芯片技術(shù)建立IVM前后CCs上基因表達(dá)譜的變化，進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞內(nèi)亞定位及定量分析的技術(shù)探討從差異表達(dá)譜篩選的某些與卵母細(xì)胞體外成熟相關(guān)生物標(biāo)記物。
　　材料與方法:
　　(1

8、)小鼠IVM模型建立:3周齡雌性ICR小鼠，予腹腔注射孕馬血清(PMSG)5U/只常規(guī)促排卵，獲取未成熟卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(GV-COCs)，參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)建立小鼠IVM平臺(tái)。
　　(2) CCs差異表達(dá)譜:分別從GV-COCs和MⅡ-COCs中剝?nèi)Cs，對(duì)應(yīng)于GV-CCs組和MⅡ-CCs組，每組包含3個(gè)混合CCs樣品（每個(gè)混合樣品含100枚COC）。分別提取總RNA，運(yùn)用基因芯片技術(shù)獲得差異表達(dá)譜。
　　(3)生物信息學(xué)

9、分析:確定差異表達(dá)基因、差異細(xì)胞功能和事件，并選擇某些候選研究基因。
　　(4)基因芯片結(jié)果驗(yàn)證:根據(jù)芯片結(jié)果中的生物信息學(xué)分析結(jié)果，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，挑選出感興趣的目的基因，運(yùn)用與芯片上樣時(shí)同樣的樣品行q-PCR水平驗(yàn)證。
　　(5)差異基因的生物學(xué)意義:在芯片結(jié)果驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，確定一些功能基因。擴(kuò)大樣本量，每組8個(gè)樣品（每個(gè)樣品含30枚COCs），重新收集樣品，行q-PCR驗(yàn)證。
　　(6)目的基因的蛋白水平表達(dá)差

10、異:分別從GV-COCs和MⅡ-COCs中剝?nèi)Cs，通過(guò)Western Blot對(duì)以上確定的功能基因行蛋白水平的定量研究，免疫熒光方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位的研究。
　　(7)統(tǒng)計(jì)方法:采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料（MⅡ率）統(tǒng)計(jì)采用卡方檢驗(yàn);計(jì)量資料（目的基因的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平）以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:

11、　　(1)在本中心成功復(fù)制小鼠IVM模型，獲得GV-COCs和IVM后的MⅡ-COCs，其平均成熟率(MⅡ％)穩(wěn)定在92.6％。
　　(2)通過(guò)基因芯片，獲得了IVM前后CCs上基因表達(dá)譜變化。按照FC≥3.0(FoldChange)，同時(shí)P≤0.05篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。①M(fèi)Ⅱ?qū)V上調(diào)基因有2615個(gè)，主要涉及基質(zhì)金屬蛋白酶調(diào)節(jié)及表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等功能;②MⅡ?qū)V下調(diào)基因有2810個(gè)，主要涉及細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)生物學(xué)事

12、件。
　　(3) qPCR驗(yàn)證芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)IVM以后CCs上ECM和EFG相關(guān)基因（PTGS2,EREG, TNFAIP6，EFEMP1）以及線(xiàn)粒體代謝相關(guān)基因（FDX1，AIFM2）表達(dá)上調(diào)了;縫隙鏈接及細(xì)胞周期相關(guān)基因(GJA1，GJA4, CCND2, CCNA2,CCNB2)表達(dá)下調(diào)了。與芯片結(jié)果一致。
　　(4)從以上目的基因中進(jìn)一步篩選出功能基因（EFEMP1，F(xiàn)DX1，GJA1，CCND2），重新收集樣品進(jìn)行

13、生物學(xué)意義的驗(yàn)證，與芯片結(jié)果一致。
　　(5)篩選出4個(gè)因子（EFEMP1，F(xiàn)DX1，GJA1，CCND2）進(jìn)行蛋白定量研究，發(fā)現(xiàn)與mRNA水平的變化一致。細(xì)胞內(nèi)定位研究發(fā)現(xiàn):①EFEMP1主要定位CCs的胞質(zhì)中，在GV-COC中僅表達(dá)在表層CCs上，內(nèi)層CCs不表達(dá)，且在GV期卵子中不表達(dá);經(jīng)過(guò)IVM后，EFEMP1表達(dá)在全層CCs上，且MⅡ其卵母細(xì)胞中高表達(dá);②FDX1也主要定位于CCs胞質(zhì)中，在GV-COC中內(nèi)外層CCs均有

14、FDX1的表達(dá)，且GV期卵母細(xì)胞中也有表達(dá);IVM后表達(dá)陽(yáng)性的CCs數(shù)目明顯增多;③GJA1只表達(dá)在CCs胞質(zhì)中，不表達(dá)與胞核中，在GV-COC中，GJA1在各層CCs中均有表達(dá);IVM后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少。且在GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞內(nèi)，GJA1均不表達(dá);④CCND2主要表達(dá)在CCs的胞核中，胞質(zhì)中少量表達(dá)，在GV-COC中，其主要表達(dá)在內(nèi)層CCs中;IVM以后這種表達(dá)極性消失，且熒光強(qiáng)度明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　(1)

15、研究生期間掌握了小鼠卵母細(xì)胞顯微鏡下操作技術(shù)，在本中心成功復(fù)制IVM模型并應(yīng)用于課題研究中。
　　(2) IVM過(guò)程中，隨著卵母細(xì)胞成熟，CCs上的基因表達(dá)譜發(fā)生一系列變化。IVM以后CCs上金屬蛋白酶調(diào)節(jié)及表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)了，細(xì)胞核相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)了?；蛐酒Y(jié)果利用qPCR技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　(3)通過(guò)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證，表明功能基因（EFEMP1，F(xiàn)DX1，GJA1，CCND2）在IVM過(guò)程中差異