卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)制與臨床應(yīng)用

1、卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)制與臨床應(yīng)用,主講人：鄭月慧南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院2017年7月8日,一、卵母細(xì)胞體外成熟的定義、應(yīng)用及其發(fā)展現(xiàn)狀二、卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)理及其調(diào)控三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評(píng)估,我將從以下三個(gè)方面陳訴：,一、卵母細(xì)胞體外成熟的定義、應(yīng)用及其發(fā)展現(xiàn)狀,卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)(IVM)是一項(xiàng)輔助生殖技術(shù)，簡(jiǎn)單地講就是，將卵巢小卵泡中的未成熟卵子取出，放在模擬體內(nèi)卵泡微環(huán)境的培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)到成熟階

2、段，排出第一極體，再進(jìn)行體外授精技術(shù)幫助受精，體外受精過程與體內(nèi)成熟的卵子大同小異。,1、什么是卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)？,,第一步：取出未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)至成熟,,第三步： 胚胎移植,IVM Treatment,第二步：體外受精,一、卵母細(xì)胞體外成熟的定義、應(yīng)用及其發(fā)展現(xiàn)狀,2、未成熟卵體外成熟技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展 上世紀(jì)九十年代，試管嬰兒之父——愛德華茲先生就把卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)（IVM），作為輔助生殖技術(shù)未

3、來(lái)發(fā)展的三大前景技術(shù)之一，其它兩個(gè)技術(shù)是微刺激和自然周期試管嬰兒技術(shù)。 近十余年來(lái)，IVM技術(shù)遍布全世界，對(duì)于一種不用或減少卵巢刺激，提高患者舒適度的治療理念，人們一直在努力嘗試更好的體外培養(yǎng)條件，以獲得更高的成功率,目前應(yīng)用,,卵巢多囊綜合征（PCOS）患者,卵巢高度反應(yīng)有卵巢過度刺激綜合征（OHSS）病史,卵巢不適于藥物刺激而本身又沒有成熟卵泡生長(zhǎng),對(duì)自然周期IVF治療同時(shí)取出其余小卵泡（IVF/IVM）,一、卵母

4、細(xì)胞體外成熟的定義、應(yīng)用及其發(fā)展現(xiàn)狀,3、體外成熟技術(shù)安全嗎？ 這同樣也是我們醫(yī)護(hù)人員們最為關(guān)心的問題。 IVM出生的孩子遍布世界各地，目前全世界大概有5000～10000名體外成熟卵試管嬰兒健康成長(zhǎng)。其妊娠率可達(dá)到與體內(nèi)成熟卵相當(dāng)（35～50%）。結(jié)果表明，較其他輔助生殖技術(shù)，IVM技術(shù)并沒有增加子代異常的風(fēng)險(xiǎn) 但是，畢竟卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)，將使卵子暴露于體外條件更長(zhǎng)時(shí)間，理論上增加了卵子受培養(yǎng)環(huán)

5、境影響的風(fēng)險(xiǎn)，在基因編程、表觀遺傳學(xué)、倫理學(xué)等方面，還需要更加深入的研究和探索。因此目前該技術(shù)只是適用于特殊人群，還沒有普及到每一例試管嬰兒,二、卵母細(xì)胞體外成熟的機(jī)理及其調(diào)控,與自然狀態(tài)下和傳統(tǒng)的IVF等輔助生殖技術(shù)中卵母細(xì)胞成熟方式不同，IVM未成熟卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂在體外完成，該過程受如下多種因素影響： 1、取卵方式與時(shí)間 2、體外培養(yǎng)方法 3、IVM實(shí)施方案,卵母細(xì)胞體外成熟,? 取卵方式與時(shí)間,? 體

6、外培養(yǎng)方法,? 培養(yǎng)液添加成分,,,,1、取卵方式與時(shí)間IVM取卵方式：?直接從陰道采集 ?從手術(shù)切除的體外卵巢組織上采集,IVM的卵母細(xì)胞恢復(fù)能力受陰道采集時(shí)抽吸壓力和針頭型號(hào)的影響：較高吸取壓力（大約為56 mm Hg）和較粗針頭有利于卵母細(xì)胞恢復(fù)。有文獻(xiàn)報(bào)道，將卵母細(xì)胞采集針反復(fù)在卵巢基質(zhì)上抽吸的過程中逐漸增加抽吸壓力，可采集到更多卵泡。,IVM取卵時(shí)間：,由于未成熟卵母細(xì)胞主要來(lái)源于小卵泡，所以取卵技術(shù)略不同于含有

7、成熟卵子的大卵泡。取卵難度相對(duì)大一些，因?yàn)槁殉灿蝿?dòng)度較大，患者容易產(chǎn)生不適，所以一般都在麻醉下完成取卵。一般每個(gè)患者大約可以取到7～30余個(gè)不成熟卵子。卵泡越小，卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂進(jìn)而發(fā)育成熟的能力越弱，但體積較大的優(yōu)勢(shì)卵泡可分泌大量雌激素而引起周圍卵泡閉鎖。因此，過早或過晚結(jié)束培養(yǎng)都會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。目前，一般在卵泡直徑達(dá)到10～12 mm時(shí)結(jié)束培養(yǎng),100um,2、體外培養(yǎng)方法,體外培養(yǎng)方法可分為如下幾類：,3、

8、IVM實(shí)施方案根據(jù)Gn使用情況，將IVM實(shí)施方案大致分為以下幾種：,一般來(lái)講，未成熟卵子需要在體外培養(yǎng)24～48小時(shí)，國(guó)際報(bào)道的成熟率可以達(dá)到60～75%。這些體外成熟卵子可以體外受精發(fā)育成胚胎，進(jìn)行宮腔移植。,三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評(píng)估,（圖：胚胎發(fā)育的不同階段）,1、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化?培養(yǎng)液的優(yōu)化：將未成熟的小竇狀卵泡從人體內(nèi)取出后，卵母細(xì)胞所處環(huán)境即發(fā)生變化，與其直接接觸的培養(yǎng)液成分將對(duì)卵母細(xì)胞

9、的發(fā)育、成熟、受精能力等產(chǎn)生重要的影響。,三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評(píng)估,三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評(píng)估1、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化,體外成熟卵子的體外授精：既可采用常規(guī)體外授精技術(shù)完成受精，或用單精子卵胞漿內(nèi)注射（ICSI）技術(shù)授精。為了提高受精率，卵子體外成熟后一般建議選擇ICSI授精方式。,?授精方式的優(yōu)化：,單精子顯微注射流程圖,三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評(píng)估1、卵母細(xì)胞體外成熟

10、技術(shù)的優(yōu)化,?胚胎移植前的優(yōu)化：,移植前胚胎的輔助孵出（AH）：就是采用激光在胚胎的透明帶上產(chǎn)生一個(gè)薄弱點(diǎn)，輔助囊胚易于孵出著床。因?yàn)槁炎芋w外成熟的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，理論上卵子的透明帶結(jié)構(gòu)可能比較厚硬，為了提高著床率，移植前往往建議進(jìn)行胚胎的輔助孵出。,,,三、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的優(yōu)化和臨床應(yīng)用評(píng)估2、卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的臨床應(yīng)用評(píng)估,由于卵泡未成熟體積小，取卵需要特定裝備與高超技術(shù)，培養(yǎng)技術(shù)也非同一般，體外受精則必需顯微操作,術(shù)前

11、不需要應(yīng)用昂貴藥物刺激，可以避免藥物治療副作用，大大減少費(fèi)用且降低本病常見的促排卵引起的卵巢過度刺激綜合征風(fēng)險(xiǎn),優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn),,,謝謝大家！,一、Ghrelin對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響,1 Ghrelin的結(jié)構(gòu)及其分布2 Ghrelin受體的信號(hào)通路及其分布3 Ghrelin對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響,? Ghrelin的結(jié)構(gòu)哺乳動(dòng)物中，Ghrelin被發(fā)現(xiàn)是一種協(xié)調(diào)能量和生殖活動(dòng)平衡的促進(jìn)食欲的胃腸激素，是生長(zhǎng)激素促分泌物受體（Growth

12、 hormone secretagogue receptor，GHS-R ）的內(nèi)源性配體,Ghrelin是28個(gè)氨基酸組成的肽，其第三個(gè)絲氨酸是N端?；?，這是ghrelin活性所必需的。大鼠和人類的Ghrelin只有兩個(gè)氨基酸殘基的差異,圖1 調(diào)節(jié)垂體生長(zhǎng)激素釋放（引自Kojima M and Kangawa K,2005),圖2 人和大鼠Ghrelin的結(jié)構(gòu)（引自Kojima M and Kangawa K,2005),

13、1 Ghrelin的結(jié)構(gòu)及其分布,Ghrelin,影響食物攝入、睡眠和行為,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化,影響心臟功能與血管阻力,影響能量代謝和糖代謝,影響胃酸分泌與胃運(yùn)動(dòng),影響胰腺外分泌和內(nèi)分泌功能,刺激GH、ATCH、PRL的分泌,2 Ghrelin的結(jié)構(gòu)及其分布,影響生殖功能,,,,,,,,,2 Ghrelin受體的信號(hào)通路及其分布,Ghrelin受體（GHS-R）是典型的七次跨膜G蛋白偶聯(lián)體，受體有7次跨膜的α螺旋區(qū)和3個(gè)細(xì)胞內(nèi)和外的氨基

14、酸環(huán),?GHS-R和GHRH引起GH釋放的信號(hào)通路（引自 Teresa Lorenzi et al.）,絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI-3激酶是主要參與激活核轉(zhuǎn)錄因子以控制細(xì)胞增殖，分化和凋亡的絲氨酸/蘇氨酸激酶,?ghrelin作用ERK1/2和PI-3激酶信號(hào)通路（引自 Choi K et al.）,3 Ghrelin對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響,? 體外成熟過程中卵母胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA相對(duì)表達(dá)量隨著成熟進(jìn)

15、程顯著下降,? Ghrelin蛋白在牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，而GHS-R蛋白則特異性的定位于卵母細(xì)胞膜表面，在卵丘細(xì)胞中均有Ghrelin和GHS-R蛋白表達(dá)。,? FSH抑制卵母細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表達(dá)，而FSH顯著促進(jìn)卵丘細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA表達(dá)；FSHBI解除FSH對(duì)卵母細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表達(dá)的抑制作用和FSH對(duì)卵丘細(xì)胞Ghrelin和GHS-R1a m

16、 RNA表達(dá)的促進(jìn)作用,二、褪黑素對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響,1褪黑素的結(jié)構(gòu)及其分布2褪黑素受體及其信號(hào)通路3 褪黑素Ghrelin對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響,,1 褪黑素的結(jié)構(gòu)及其分布,褪黑素（Melatonin, MT），化學(xué)結(jié)構(gòu)為乙?；籽趸?，分子量為，是首先在松果體中發(fā)現(xiàn)的一種胺類物質(zhì)，褪黑素合成前體是色氣酸,主要用途,抗擊腫瘤,改善睡眠,調(diào)節(jié)免疫,延緩衰老,,2褪黑素受體及其信號(hào)通路,MT1和MT2褪黑素受體信號(hào)通路：A:褪黑

17、素和MT1受體結(jié)合后激活兩條通路，通過Gq偶聯(lián)受體α-亞單位抑制cAMP的合成及通過βr亞單位增強(qiáng)憐酸肌醇的分解。B：MT2褪黑素和結(jié)合后的信號(hào)通路。,3 褪黑素對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響,褪黑素具有抗氧化活性，褪黑素能通過多條途徑降低氧化應(yīng)激，是一種高效的自由基清除劑。,圖為褪黑素在卵泡中的作用示意圖。褪黑素可以調(diào)控卵泡壁細(xì)胞和顆粒細(xì)胞固醇類合成酶的表達(dá)而影響類固醇激素的分泌。褪黑素同時(shí)可以調(diào)控LHmRNA的表達(dá)，Bcl2和Casp3的

18、生成，IGF和TGF-β的活性和成熟透導(dǎo)激素的活性。褪黑素能調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞SOD、Gpx和CAT的表達(dá)。過多ROS的會(huì)引起凋亡和卵泡閉鎖，而卵泡內(nèi)的視黑素可以直接或間接清除ROS而抑制卵泡閉鎖，從而使卵泡繼續(xù)發(fā)育為優(yōu)勢(shì)卵泡。,三、白藜蘆醇對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響,1 白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)2 白藜蘆醇作用相關(guān)信號(hào)通路及其分布3 白藜蘆醇對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響,白黎蘆醇（Resveratrol，RES)是一類多齡類化合物，存在于紅色葡萄皮、紅

19、酒或其他的植物提取物中。,1 白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì),分子式,相關(guān)保健品,2 白藜蘆醇作用相關(guān)信號(hào)通路,在哺乳動(dòng)物中白黎蘆醇是SIRT 1的激活劑，能夠保護(hù)線粒體的功能，除此之外，還具有抗氧化、抗衰老等生物學(xué)作用,白藜蘆醇,減少臟器纖維化,促進(jìn)臟器結(jié)構(gòu)功能恢復(fù),恢復(fù)氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài),恢復(fù)能量代謝穩(wěn)態(tài),3 白藜蘆醇對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響,? 白黎蘆醇能夠提高女性GV期卵母細(xì)胞的成熟；? 白黎蘆醇能改善卵母細(xì)胞線粒體的功能；? 白