青石斑魚B淋巴細胞刺激因子(BAFF)及斑馬魚TNFSF14的克隆、表達及生物學功能研究.pdf

1、B淋巴細胞刺激因子(BAFF)和T細胞上可誘導表達的、與HSV的糖蛋白D競爭結合HVEM的淋巴毒素類似物(LIGHT)都是TNF超家族的重要成員。BAFF廣泛參與B淋巴細胞的生長、發(fā)育和分化，LIGHT能夠刺激T淋巴細胞的增生、誘導和調節(jié)腫瘤細胞凋亡等功能，二者在淋巴器官的發(fā)生、自身免疫病、抗病毒免疫等均發(fā)揮重要作用。到目前為止，對于石斑魚BAFF基因和斑馬魚LIGHT基因的研究在國內外還處于空白狀態(tài)。
　　1、青石斑魚B淋巴細胞

2、刺激因子的克隆、表達及其生物活性的研究。
　　本實驗通過RT-PCR和RACE技術，從青石斑魚脾臟組織中擴增得到B淋巴細胞因子(EaBAFF)的全長eDNA序列，該基因全長1442bp，包括5'和3'端非編碼區(qū)以及780 bp的開放閱讀框（編碼259個氨基酸）。與其它物種已知BAFF特征相同，EaBAFF的氨基酸序列也含有一個預測跨膜區(qū)、潛在的弗林酶切位點、三個半胱氨酸殘基、一個典型的TNF結構域。預測的三維結構與人的三維結構極其

3、相似。實時定量PCR表明EaBAFF主要表達在青石斑魚脾臟中。pET28a-EasBAFF質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達了His6-EasBAFF融合蛋白，對鎳柱純化得到的融合蛋白進行SDS-PAGE和western blot分析鑒定。激光共聚焦結果顯示該蛋白可以與青石斑魚和小鼠的淋巴細胞表面的受體結合，體外WST-8檢測表明His6-EasBAFF能夠促進青石斑魚淋巴細胞和小鼠B淋巴細胞的存活。我們的研究結果或許能夠為青石

4、斑魚免疫系統(tǒng)的研究提供理論依據(jù)，EasBAFF有可能作為免疫增強劑增強魚體抵抗力。
　　2、斑馬魚LIGHT的克隆、表達及活性分析。
　　應用RT-PCR技術，從斑馬魚脾臟組織中擴增的到LIGHT的全長CDS序列，zLIGHT的開放閱讀框為708bp，編碼235個氨基酸。zLIGHT含有預測跨膜區(qū)以及典型的胞外TNF結構域。實時定量PCR表明zLIGHT主要表達在斑馬魚脾臟和腎臟，pSUMO-zsLIGHT質粒能夠在大腸桿菌