芪蛭皺肺顆粒對(duì)LPS誘導(dǎo)致炎肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的增殖和生物學(xué)活性的影響.pdf

1、目的：探究新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ)的原代培養(yǎng)方法。通過(guò)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制造細(xì)胞炎癥模型,芪蛭皺肺顆粒給藥干預(yù),觀察其對(duì)致炎 AT-Ⅱ細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)周期、線粒體活性、肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的影響。以探察其防治慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的作用機(jī)

2、制,同時(shí)為開(kāi)發(fā)研究芪蛭皺肺顆粒提供藥效學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：取SPF級(jí)新生Wistar大鼠肺臟,采用胰蛋白酶聯(lián)合膠原酶消化法分離 AT-Ⅱ細(xì)胞,免疫黏附結(jié)合反復(fù)貼壁法純化細(xì)胞,體外培養(yǎng)細(xì)胞,透射電鏡鑒定細(xì)胞。細(xì)胞造模方法:10組生長(zhǎng)狀態(tài)及數(shù)目接近的細(xì)胞,2組不加 LPS,2組加5ug/ml的 LPS,2組加10ug/ml的 LPS,2組加20ug/ml的 LPS,2組加40ug/ml的 LPS,干預(yù)1天。第二天,向用5種濃度 LPS

3、干預(yù)過(guò)的細(xì)胞其中一組加入100ug/ml的芪蛭皺肺顆粒,干預(yù)2天,同濃度的另一組作對(duì)照。觀察并檢測(cè)各組AT-Ⅱ細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,板層小體、線粒體和生長(zhǎng)周期的變化,以及 SP-A的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)原代培養(yǎng)的 AT-Ⅱ細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。(2)電鏡下觀察到板層小體。LPS組板層小體數(shù)目減少,芪蛭皺肺顆粒干預(yù)組其數(shù)目有所增加。(3) MTT顯示,LPS組 AT-Ⅱ細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖情況,且其增殖率隨 LPS濃度的升高而加強(qiáng)。芪蛭皺肺

4、顆粒干預(yù)后,細(xì)胞增殖受到了抑制,增殖率有所下降。(4)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,LPS組 AT-Ⅱ細(xì)胞的細(xì)胞周期處于 G2期和 S期的百分比較高。其增殖百分比隨著 LPS濃度的升高而上升。芪蛭皺肺顆粒干預(yù)后,G2期和 S期的百分比有所下降。(5)激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體羅丹明123染色結(jié)果顯示,空白組細(xì)胞的線粒體活性強(qiáng),熒光亮度高。LPS組隨著其濃度的升高,熒光強(qiáng)度逐漸減弱。加入芪蛭皺肺顆粒干預(yù)后,熒光強(qiáng)度有所恢復(fù)。(6)SABC免疫組化

5、法檢測(cè) SP-A顯示:①DAB顯色:空白組的 AT-Ⅱ細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以觀察到較多的棕黃色顆粒?？瞻准榆悟伟櫡晤w粒組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較空白組更多的棕黃色顆粒,顏色較深。而 LPS組細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒明顯減少,且 LPS濃度越高,其棕黃色顆粒越少、顏色越淺。芪蛭皺肺顆粒干預(yù)組的細(xì)胞內(nèi),棕色顆粒較之同濃度LPS誘導(dǎo)組有所增加,且顏色有一定加深。②FITC熒光染色:空白組的 AT-Ⅱ細(xì)胞熒光較強(qiáng)。空白加芪蛭皺肺顆粒組細(xì)胞熒光強(qiáng)度較空白組更大。而LPS組細(xì)胞

6、熒光強(qiáng)度減弱,且隨著 LPS濃度的增高,熒光越來(lái)越淡,芪蛭皺肺顆粒干預(yù)組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度較之同濃度 LPS誘導(dǎo)組有所增加。
　　結(jié)論：本次實(shí)驗(yàn)提取的原代 AT-Ⅱ細(xì)胞符合體外實(shí)驗(yàn)要求,第24~72 h內(nèi)處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài),是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的理想時(shí)間段。LPS可以促使 AT-Ⅱ細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)而異常增殖,并減弱 AT-Ⅱ細(xì)胞的 SP-A表達(dá),降低該細(xì)胞的生物學(xué)活性。芪蛭皺肺顆粒對(duì) LPS誘導(dǎo)致炎肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的異常增殖有抑制作用,可改善