天然小分子化合物X15-2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的研究.pdf

1、細(xì)胞自噬(autophagy)是指隔離膜(isolation membrane)的雙層膜組分識(shí)別并包裹細(xì)胞內(nèi)待降解的錯(cuò)誤折疊蛋白或受損細(xì)胞器，通過膜的生長(zhǎng)融合形成自噬小體(autophagosome)，自噬小體通過與溶酶體(lysosome)融合被溶酶體內(nèi)的酸性蛋白水解酶降解，生成氨基酸等小分子以循環(huán)利用的過程。作為細(xì)胞內(nèi)主要的降解途徑，自噬從酵母到哺乳動(dòng)物中高度保守。Beclin1在自噬調(diào)節(jié)中的作用已經(jīng)有很多報(bào)道，最新的研究表明Bec

2、lin2也參與自噬的調(diào)節(jié)，并且能夠和一些已知的Beclin1結(jié)合蛋白相互作用。但是Becin1和Beclin2是如何協(xié)同調(diào)節(jié)自噬的目前還不清楚。自噬不僅廣泛存在于正常的生理過程中，而且作為一種防御機(jī)制清除入侵的病原菌，同時(shí)還參與許多病理過程，比如異常結(jié)構(gòu)的降解、腫瘤的抑制等。有報(bào)道表明一些化合物能夠通過誘導(dǎo)自噬而緩解帕金森癥狀。
　　我們首先利用GFP-LC3穩(wěn)定表達(dá)的HeLa細(xì)胞，通過高通量篩選的方法對(duì)一批天然小分子化合物進(jìn)行篩

3、選。發(fā)現(xiàn)了一種真菌來源的小分子化合物X15-2能有效誘導(dǎo)自噬發(fā)生，且細(xì)胞毒性較低。通過免疫熒光和western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了X15-2的確能夠誘導(dǎo)自噬。我們還發(fā)現(xiàn)X15-2能引起線粒體形態(tài)改變，網(wǎng)絡(luò)狀的線粒體變的破碎，同時(shí)X15-2可誘導(dǎo)線粒體膜電位的下降，活性氧基團(tuán)(reactive oxygen sepsis，ROS)上升，ROS的上升對(duì)于X15-2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生是必需的，ROS的清除劑NAC可以有效抑制X15-2

4、誘導(dǎo)的ROS上升及細(xì)胞自噬的發(fā)生。此外，敲減自噬關(guān)鍵基因Atg5能夠抑制X15-2誘導(dǎo)的自噬;單獨(dú)敲低Beclin1或者Beclin2并不影響X15-2誘導(dǎo)的自噬，但當(dāng)Beclin1和Beclin2同時(shí)被敲低時(shí)，X15-2誘導(dǎo)的自噬減弱，說明X15-2誘導(dǎo)的自噬依賴于Atg5，并且依賴Beclin1和Beclin2。雖然X15-2能夠減弱Bcl-xL與Beclin1的相互作用，但Bcl-xL和Bcl-2高表達(dá)卻不能抑制X15-2誘導(dǎo)的自

5、噬。因此Beclinl和Beclin2可能通過其他的方式協(xié)同調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生。
　　路易式小體被認(rèn)為是神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志物。有報(bào)道認(rèn)為路易式小體中的α-synuclein能通過自噬途徑降解。促進(jìn)α-synuclein自噬性降解有可能給疾病的治療帶來新的希望。因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)了X15-2是否能夠通過誘導(dǎo)自噬降解α-synuclein。我們構(gòu)建了一個(gè)GFP標(biāo)簽的α-synuclein穩(wěn)定表達(dá)HeLa細(xì)胞和四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)α-synu

6、clein的HeLa細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)X15-2處理能夠誘導(dǎo)α-synuclein依賴于自噬-溶酶體途徑的降解，并且這種降解是Atg5依賴的。
　　綜上所述，我們篩選到了一個(gè)能夠誘導(dǎo)自噬的化合物X15-2，ROS在該化合物誘導(dǎo)的自噬中起著重要作用。X15-2誘導(dǎo)的自噬是依賴于Atg5和Beclin1、Beclin2的。我們還發(fā)現(xiàn)X15-2能夠通過誘導(dǎo)自噬降解α-synuclein。X15-2誘導(dǎo)自噬的機(jī)制仍然不是很清楚，接下里我們將繼