VEGF轉染臍帶間充質(zhì)干細胞促血管新生改善糖尿病下肢缺血的實驗研究.pdf

1、糖尿病外周血管病變(diabetic peripheral artery disease，PAD)是糖尿病(diabetic mellitus，DM)嚴重的慢性并發(fā)癥之一，與非DM患者相比，其主要病理改變?yōu)閯用}粥樣硬化，且多累及下肢遠端動脈，病變范圍更廣、呈多節(jié)段彌漫性的狹窄或閉塞，是導致DM足部壞疽、截肢的主要原因，嚴重影響DM患者的生存質(zhì)量。目前傳統(tǒng)內(nèi)科藥物、介入和手術治療等對遠端血管閉塞、流出道差的DM患者效果不佳，不能從根本上解

2、決問題，并且此類DM患者多數(shù)高齡體弱，手術風險大，合并多種心腦血管病變，病情復雜，因此臨床治療上相當棘手，迫切需要尋求新的技術手段，如何促進血管新生實現(xiàn)血運重建成為治療關鍵。
　　近年來干細胞移植成為發(fā)展迅速的一種全新治療模式，其中骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)已被證實是一類具有多向分化潛能的干細胞，可以在一定的誘導條件下分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、心肌、血管內(nèi)

3、皮細胞等，參與不同組織的修復，但目前仍缺乏移植細胞在體內(nèi)存活、分化、轉歸及參與血管再生的實驗依據(jù)可循，且骨髓MSCs采集風險較大，對患者年齡、身體條件、心理接受程度要求較高，在實際應用中，由于高糖、氧化應激、低氧等微環(huán)境使移植后MSCs的存活率非常低，新生血管形成速度慢等，極大地限制了干細胞移植治療的效果。相比之下，臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells，hUC-MSCs)

4、與BMSCs在生物學特性方面極為相似，由于其來源更廣泛，采集方便，擴增力可塑性強，無免疫原性，不存在倫理學爭議，具有更加有效的MSCs潛能，有可能成為BMSCs的理想替代物，成為目前誘導分化最佳的種子細胞。
　　對血循環(huán)的重建而言，目前已知有多種細胞因子和生長因子參與促進血管生成作用，其中血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)通過與其血管內(nèi)皮特異性受體結合，可顯著促進內(nèi)皮

5、增生及血管生成作用，被認為是機體內(nèi)最強的促血管生長因子，但直接應用VEGF治療存在很多不足，如半衰期短、提純較為困難、應用量大、成本昂貴等，限制其臨床應用。
　　因此，如何提高MSCs在缺血組織存活、分化，增加局部組織生長因子分泌量，促進新生血管形成，提高MSCs治療PAD療效是目前亟待解決的主要問題。
　　本研究利用基因工程構建VEGF-EGFP基因表達載體，通過腺病毒轉染到hUC-MSCs細胞中，觀察基因轉染后對hUC-

6、MSCs的生長增殖及目的基因VEGF表達情況;并利用增強型綠色熒光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)實現(xiàn)轉染后hUC-MSCs的活體示蹤定位;同時建立高脂喂養(yǎng)2型糖尿病SD大鼠下肢缺血模型，將轉染后的hUC-MSCs局部肌肉注射，觀察其向血管內(nèi)皮分化促血管新生，側支循環(huán)的建立，改善下肢缺血的實驗療效;本研究應用hUC-MSCs作為VEGF基因治療平臺，不僅可通過提高VEGF持續(xù)分泌，達到

7、局部穩(wěn)定的治療濃度，并通過VEGF的抗炎、抗氧化應激、抗凋亡、促進血管生成等作用改善缺血后微環(huán)境，為hUC-MSCs增殖、分化等過程提供最佳的生存空間;同時可放大hUC-MSCs的旁分泌作用，減少hUC-MSCs凋亡，提高hUC-MSCs移植后的定位歸巢和存活率等，有效發(fā)揮VEGF與hUC-MSCs在血管再生功效方面的協(xié)同倍增作用，從而為更好的發(fā)揮hUC-MSCs移植療效提供實驗基礎。本研究分為三部分:
　　第一部分腺病毒介導VE

8、GF轉染臍帶間充質(zhì)干細胞的實驗研究
　　目的:探討腺病毒載體介導VEGF轉染hUC-MSCs的可行性，以及VEGF轉染對hUC-MSCs形態(tài)及功能的影響。
　　方法:構建VEGF-EGFP重組基因腺病毒載體，分離和培養(yǎng)hUC-MSCs，分為VEGF-EGFP轉染組、EGFP空載組及對照組，熒光倒置顯微鏡觀察細胞轉染效果，流式細胞儀測定細胞轉染效率，確定最佳病毒感染復數(shù)(multiplicities of infection，

9、MOI);依據(jù)最佳MOI值轉染并收集細胞，應用蛋白印跡法(Western blot)、RT-PCR檢測轉染后目的基因VEGF的蛋白及mRNA表達情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清VEGF蛋白水平，MTT法及流式細胞術評價基因轉染對hUC-MSCs增殖和細胞周期的影響。
　　結果:熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測提示腺病毒介導的VEGF-EGFP基因能夠成功轉染hUC-MSCs，且轉染效率高，對細胞結構形態(tài)無影響;目的基

10、因VEGF在細胞內(nèi)能夠轉錄和表達，并能分泌到細胞外，轉染后24h采用ELISA法在細胞培養(yǎng)上清中就檢測到有VEGF的表達和分泌，96h仍穩(wěn)定表達;與對照組和EGFP空載組相比，通過Western blot、RT-PCR檢測VEGF-EGFP轉染組VEGF表達水平升高顯著，且表達穩(wěn)定，可提高hUC-MSCs的抗凋亡及存活能力;MTT及流式細胞法檢測結果顯示VEGF基因轉染可提高hUC-MSCs增殖和分化能力。
　　結論:腺病毒介導V

11、EGF基因能夠成功轉染hUC-MSCs，能持續(xù)穩(wěn)定、高效表達VEGF，改善生存微循環(huán)，提高hUC-MSCs的增殖及分化、存活能力，為開展VEGF基因轉染hUC-MSCs移植治療改善糖尿病下肢血管病變的可行性提供理論依據(jù)。
　　第二部分高脂喂養(yǎng)2型糖尿病大鼠下肢缺血模型建立
　　目的:目前普遍采用大鼠后肢股動脈結扎離斷的方法來制備后肢急性缺血模型，但對于如何建立及評估糖尿病高脂高血糖慢性動脈硬化閉塞癥的缺血狀態(tài)，尚無一個穩(wěn)定有

12、效慢性缺血模型及方法。
　　方法:將大鼠20只隨機分為2組，DM組10只予以高脂喂養(yǎng)6個月，腹腔注射（Streptozocin，STZ）(35mg/kg)誘發(fā)糖尿病模型，對照組(10只)予以普食喂養(yǎng)6個月，成模DM組及對照組大鼠在麻醉后，消毒鋪巾，沿右下肢正中的皮膚縱行切開，于腹股溝下分離出股動脈，在腹股溝韌帶下切斷股動脈，近端結扎，隨后向遠端銳性剝離直至膝關節(jié)，分離和結扎股動脈的所有分支，造成右下肢缺血模型，術后3d、7d、14

13、d、28d觀察大鼠患肢活動狀況、肢體顏色、皮溫等，并于術后1d、3d、14d、28d常規(guī)麻醉后，保持溫度、光線相對恒定下，應用PeriScan PIM3激光多普勒（Laser Doppler Perfusion Imaging，LDPI）行下肢血流監(jiān)測。術后28d麻醉動物后，切開后腹膜，于腹主動脈留置套管針，肝素鈉抗凝，以2 ml/s的速率注射造影劑約1.5 ml進行CT下肢血管造影。每組動物在血管造影后處死，分別取其健側和患側股四頭肌

14、和腓腸肌行蘇木精-伊紅染色及CD31免疫組織化學染色、Western blot測定肌肉組織VEGF含量。
　　結果:DM組有（8只）對照組（10只）制備成后肢缺血模型，術后第1d，兩組大鼠多普勒血流及CT血管造影均呈顯著降低提示缺血造模成功，兩組術后第7d和14d行激光多普勒提示缺血肢體血流有逐漸恢復趨勢，術后第28d DM組血流恢復較對照組顯著遲緩(P＜0.05);CT血管造影:DM組右下肢股動脈結扎處近端僅有少量血管代償性增加

15、，遠心端仍無明顯血流;病理組織及免疫組化染色:術后第28d DM組缺血部位肌肉組織出現(xiàn)組織結構破壞，炎性細胞浸潤，毛細血管密度患側低于健側;缺血肌肉組織VEGF較對照組的蛋白表達明顯增加(P＜0.05)。
　　結論:長期高脂喂養(yǎng)糖尿病模型基礎上，制作股動脈結扎離斷的下肢缺血模型，更接近于糖尿病下肢慢性缺血的情況，320排CT血管造影技術可以更立體直觀評估缺血狀態(tài)，為進一步探討糖尿病下肢缺血病理機制及干細胞治療促血管新生等提供了較為

16、理想的動物模型及評估指標。
　　第三部分 VEGF-EGFP轉染臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療改善糖尿病大鼠下肢缺血的實驗研究
　　目的:通過腺病毒將重構的VEGF-EGFP基因轉染到hUC-MSCs細胞中，同時建立高脂喂養(yǎng)2型糖尿病SD大鼠下肢缺血模型，將轉染后hUC-MSCs局部下肢肌肉注射，觀察血管新生，側支循環(huán)建立，下肢缺血改善的實驗療效。
　　方法:利用高脂飲食STZ誘導的2型糖尿病SD大鼠下肢股動脈結扎建立缺血模

17、型后，將分組觀察VEGF-EGFP-hUC-MSCs、EGFP-hUC-MSCs、hUC-MSCs及PBS局部肌肉注射到下肢缺血部位，熒光倒置顯微鏡觀察移植細胞存活及定位;在治療后2、4周，激光多普勒（瑞典Peimed，LDPI）檢測局部血流;觀察下肢活動度和缺血情況;4周后利用腹主動脈結扎行下肢動脈CTA(東芝320層CT機)造影檢測雙下肢血管側支循環(huán)的形成;肌肉組織HE染色和CD31免疫組化檢測新生毛細血管數(shù)量及密度;RT-PCR、

18、Western blot等檢測組織標本中VEGF及MMP2，MMP9，TIMP1，TIMP2，ERK，AKt相關基因mRNA及蛋白的表達等。
　　結果:移植后1、2、4周熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，在下肢缺血部位有移植的EGFP標記的hUC-MSCs存活;移植后2、4周LDPI血流圖顯示VEGF-EGFP轉染組血流灌注的恢復水平要明顯高于EGFP空載組,移植4周后CT血管造影顯示VEGF-EGFP轉染組有新生側支循環(huán)，HE及免疫組化染色顯示

19、新生毛細血管明顯高均于空載組，RT-PCR及Western blot檢測組織標本VEGF-EGFP轉染組VEGF、ERK、AKt、MMP2和MMP9mRNA和蛋白水平較其他兩組顯著增高，TIMP1、TIMP2的表達無明顯差異。
　　結論:肌肉注射移植VEGF基因修飾后hUC-MSCs可在下肢缺血組織中定植存活，高效表達VEGF，促進內(nèi)皮修復，比單純hUC-MSCs更能有效地促進血管新生，明顯改善糖尿病下肢缺血狀態(tài)，為hUC-MSC