人臍帶血干細(xì)胞移植治療糖尿病鼠下肢缺血的研究.pdf

1、目的: 本研究在比較羥乙基淀粉沉淀法和Ficoll淋巴細(xì)胞分離液法制備臍帶血單核細(xì)胞基礎(chǔ)上，采用免疫磁珠分選人臍血CD34+細(xì)胞，建立一種能夠方便獲得高純度人臍血CD34+細(xì)胞的方法；同時(shí)在體外培養(yǎng)擴(kuò)增該細(xì)胞，擴(kuò)增前后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步了解CD34+細(xì)胞的特性，為其臨床應(yīng)用創(chuàng)造條件。 方法: 取足月妊娠、正常分娩的新鮮臍血，隨機(jī)分配到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組采用羥乙基淀粉法，對(duì)照組采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液法收集單個(gè)核細(xì)胞

2、(MNC)。兩組均使用MidiMACS免疫磁性吸附性分選裝置，采用CD34+細(xì)胞陽性正選法，進(jìn)行CD34+細(xì)胞的分選與純化，之后應(yīng)用包含干細(xì)胞因子(SCF)，血小板生成素(TPO)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G—CSF)的無血清培養(yǎng)液，進(jìn)行7天體外培養(yǎng)擴(kuò)增；在顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的情況，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)擴(kuò)增前后細(xì)胞CD34+細(xì)胞的純度和表面標(biāo)志。 結(jié)果: 共采集臍血20份，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組平均體積為110.2±25.2mlvs10

3、8.1±21.1ml，統(tǒng)計(jì)分析無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組獲得單核細(xì)胞數(shù)為(5.15±1.17)×109和(4.13±1.03)×109，雖然后者少于前者，但是兩者相比統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異(p=0.053)。兩組分離的CD34+細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)組多于對(duì)照(6.25±1.11)×109和(4.04±0.66)×109，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性意義(p<0.05)。MidiMACS分選的CD34+細(xì)胞的純度實(shí)驗(yàn)組為97.23±3.3％，對(duì)照組為96.2

4、3±2.3％，兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異。兩組細(xì)胞活力無差別，臺(tái)盼藍(lán)拒染細(xì)胞活力達(dá)96％以上。經(jīng)過細(xì)胞因子培養(yǎng)后實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增倍數(shù)為7.43±0.90，對(duì)照組擴(kuò)增倍數(shù)為7.06±1.01，兩組進(jìn)行t檢驗(yàn)無顯著差異(p=0.403)。培養(yǎng)后的CD34+細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀鑒定，表明細(xì)胞表面CD133、CD117均有表達(dá)。 結(jié)論: 羥乙基淀粉結(jié)合免疫磁珠分選的方法在獲得高純度CD34+細(xì)胞中有重要的意義。應(yīng)用包含細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無血清培養(yǎng)液可

5、以體外擴(kuò)增CD34+細(xì)胞。 目的: 通過高脂飲食和鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射結(jié)合制備BALB/C裸鼠糖尿病模型，觀察其血糖及胰腺病理學(xué)改變；建立糖尿病裸鼠的下肢缺血模型，觀察下肢缺血變化。 方法: 8—9周齡雄性BALB/C裸鼠，隨機(jī)分為四組，Ⅰ組給予高脂飲食4周后注射鏈脲菌素(30mg/kg)共飼養(yǎng)8周(n=10)，Ⅱ組普通飲食4周后注射鏈脲菌素(30mg/kg)共飼養(yǎng)8周(n—10)，Ⅲ組高脂飲食8周(n=10)，

6、Ⅳ組正常對(duì)照組普通飲食4周后注射等量檸檬酸鈉緩沖液(n=10)。其中Ⅰ組和Ⅳ組在8周后制作下肢缺血模型。測(cè)定小鼠血脂、血糖、糖耐量，制作胰腺切片，觀察其形態(tài)學(xué)變化；選?、窠M和Ⅳ組裸鼠，游離左下肢股動(dòng)脈及大隱動(dòng)脈、旋髂外動(dòng)脈及股動(dòng)脈肌支共四處，分別用3/0號(hào)線結(jié)扎后切斷，并且將下肢主干動(dòng)脈包括脛腓動(dòng)脈予以抽剝，制作下肢缺血模型，觀察肢體血運(yùn)，溫度，病理等變化。 結(jié)果: 注射STZ4周后Ⅰ組裸鼠血糖、總膽固醇均顯著高于空白組；形態(tài)學(xué)

7、觀察發(fā)現(xiàn)，Ⅰ組胰腺病理HE染色可見胰島淀粉樣沉積、散在分布、形狀不規(guī)則，對(duì)照組未出現(xiàn)類似變化。制作成功下肢缺血模型后觀察，在糖尿病組肢體缺血情況重，壞死范圍多，非糖尿病組多是局限于腳趾的壞死，缺血下肢皮膚的顏色較健康側(cè)加深，壞死范圍沒有糖尿病組大。糖尿病組小鼠下肢缺血自我恢復(fù)慢，兩組從第7天開始就出現(xiàn)差別，統(tǒng)計(jì)分析7天、14天和28天的時(shí)候糖尿病組血流恢復(fù)慢，兩組間采用重復(fù)測(cè)量的方差分析檢驗(yàn)有顯著性差異p<0.05。HE染色普通光學(xué)顯微

8、鏡下檢查可見正常裸鼠的骨骼肌肌纖維排列整齊，肌節(jié)清晰可見；Ⅳ組裸鼠骨骼肌肌纖維排列較紊亂，肌間質(zhì)部分纖維化，Ⅰ組即糖尿病組的紊亂更加明顯，肌肉萎縮，肌間質(zhì)部分纖維化。 結(jié)論: 高脂飲食和STZ腹腔注射結(jié)合可用于糖尿病鼠模型的制作，與人類2型糖尿病代謝特征相似，是研究人類糖尿病血管病變較理想的動(dòng)物模型。在糖尿病模型基礎(chǔ)上制作下肢無主干及其分支動(dòng)脈供血的缺血模型，更接近于重癥下肢缺血的臨床實(shí)際情況。 目的: 研究經(jīng)過培養(yǎng)擴(kuò)增

9、的臍帶血干細(xì)胞移植入糖尿病性下肢缺血模型裸鼠肢體后對(duì)缺血恢復(fù)的促進(jìn)作用；研究TGF-β1和CD105在干細(xì)胞移植中的變化及意義。 方法: 分離臍帶血CD34+細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)，并且制備糖尿病裸鼠下肢缺血模型；用Dil標(biāo)記培養(yǎng)后的干細(xì)胞和單核細(xì)胞；動(dòng)物分組：Ⅰ組移植經(jīng)過培養(yǎng)的CD34+的臍帶血干細(xì)胞(n—10)，Ⅱ組移植從臍帶血分離的單核細(xì)胞(n=10)，Ⅲ組注射相同體積的PBS+0.1％BSA(n＝10)；在細(xì)胞培養(yǎng)7天后，將

10、6.68×105/個(gè)細(xì)胞注射到缺血肢體，此時(shí)為缺血模型制作成功后3天；采用激光多普勒血流灌注測(cè)量移植前，移植后3、7、14、28天檢測(cè)三組溫度變化，免疫組化檢側(cè)毛細(xì)血管密度。在移植后12小時(shí)和28天時(shí)每組分別取5只進(jìn)行實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblotting檢測(cè)TGF-β1和CD105在細(xì)胞移植后的變化。 結(jié)果: 經(jīng)過標(biāo)記的細(xì)胞在Ⅰ組中可以觀察到，移植細(xì)胞聚集在肌束周圍。Ⅲ組中沒有發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞

11、，Ⅱ組中有少量標(biāo)記的移植細(xì)胞發(fā)現(xiàn)。從第14天開始，Ⅰ組的溫度恢復(fù)明顯好于Ⅱ組和Ⅲ組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異p<0.05。在Ⅰ組血管密度明顯增多。Ⅱ組亦有新生血管，密度大于Ⅲ組，明顯小于Ⅰ組，Ⅲ組中血管密度改變較小。Ⅰ組中有人源的單克隆抗體HNA表達(dá)。細(xì)胞移植后12小時(shí)，TGF-β1mRNA和CD105mRNAⅠ組高于Ⅱ組和Ⅲ組，Ⅱ組和Ⅲ組相比，前者較后者有增高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，28天時(shí)各組間無明顯差異。Westernbl

12、otting檢測(cè)移植后12小時(shí)TGFβ1和CD105蛋白，Ⅰ組明顯高于Ⅱ組和Ⅲ組，Ⅱ組高于Ⅲ組，差異有顯著性(p<0.05)。28天，檢測(cè)TGFβ1和CD105蛋白的變化發(fā)現(xiàn)，Ⅰ組TGF-β1明顯高于Ⅱ組和Ⅲ組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(p<0.05)，Ⅱ組和Ⅲ組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異。 結(jié)論: 移植培養(yǎng)擴(kuò)增的臍帶血干細(xì)胞可以改善糖尿病裸鼠缺血局部的皮溫、增加缺血局部的血管密度、促進(jìn)缺血恢復(fù)；缺血組織中TGF-β1和CD10