人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及其對T細(xì)胞負(fù)性協(xié)同抑制作用.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是來源于發(fā)育中胚層的一類多能干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，它在特定誘導(dǎo)條件下可分化為多種類型的組織細(xì)胞，可形成骨、軟骨、脂肪、心肌等多種組織。最初MSCs來源于骨髓，由于人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在骨髓中含量極少，一般僅為骨髓細(xì)胞量的0.01％-0.001％，且取材較難，近年來已成功從胎

2、盤、臍血、密致骨、脂肪、肌肉等多種組織中分離，而原被作為“廢棄物”丟棄的胎盤，取材相對容易。本文旨在從成熟胎盤中獲得胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞(placenta derived mesenchymal stem cells，PMSCs)，，并研究比較了PMSCs與BMSCs的免疫生物學(xué)特性。 近年的研究表明，MSCs除能支持體外造血、促進(jìn)體內(nèi)造血重建，還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用抑制同種異體免疫排斥反應(yīng)，在異基因干細(xì)胞移植時能降低宿主

3、抗移植物反應(yīng)(HVGR)和移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)、可延長移植物生存時間，提高移植成功率，是一種較為理想的組織工程種子細(xì)胞，但具體的免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，人PMSCs對T細(xì)胞活化、增殖有抑制作用。現(xiàn)有實驗表明人PMSCs不表達(dá)HLA-DR，PMSCs具有低免疫原性，而對于胎盤源MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的報道較少。本實驗從人胎盤中分離獲取MSCs,并對其生物學(xué)特性與BMSCs進(jìn)一步比較，并觀察了高表達(dá)負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-

4、L1的PMSCs在體外對T細(xì)胞周期和活化、對細(xì)胞因子的分泌等方面的調(diào)節(jié)作用，為臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供實驗的理論依據(jù)。 第一部分人胎盤源與人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離及生物學(xué)特性的比較 目的：比較人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞(HPMSCs)與人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞(HBMSCs)的體外分離的方法及兩種細(xì)胞生物學(xué)特性。 方法：采取酶消化法分離人胎盤組織，用密度梯度離心法分離骨髓單個核細(xì)胞，分別進(jìn)行貼壁分離和傳代培養(yǎng)，通過倒置

5、相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)做比較性分析。并在誘導(dǎo)劑作用下進(jìn)行細(xì)胞分化實驗、鑒定干細(xì)胞，并用PHA刺激的T細(xì)胞與PMSCs或BMSCs共培養(yǎng)，觀察T細(xì)胞與兩者的相互作用。 結(jié)果：(1)兩種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞均貼壁生長、呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)、表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166，但不表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR分子；(2)兩種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞均能在體外

6、向成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，(3)；兩種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外對T細(xì)胞的活化增殖有明顯的抑制作用。 結(jié)論：人PMSCs與人BMSCs具有相似的細(xì)胞體外生物學(xué)特性、表型和多向分化的潛能及其負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，是一種較為理想的組織工程種子細(xì)胞。 第二部分負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-L1在人胎盤源MSCs的表達(dá)及其負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用 目的：探討人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(PMSCs)對負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-L1的表達(dá)以及對T細(xì)

7、胞體外的負(fù)性協(xié)同作用。 方法：用體外擴(kuò)增三代后的PMSCs和HBMSCs，采用流式細(xì)胞儀和免疫熒光方法來分析兩種細(xì)胞上協(xié)同刺激分子的表達(dá)情況，3H-TdR摻入法檢測PMSCs對PHA刺激后的T細(xì)胞增殖的影響以及PD-L1單克隆抗體部分阻斷PMSCs抑制T細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析PMSCs對PHA作用下T細(xì)胞周期和早期活化分子CD69表達(dá)的影響，ELISA法檢測細(xì)胞因子水平，以及阻斷PD-L1作用后的變化。 結(jié)果：(

8、1)人PMSCs和HBMSCs均不表達(dá)CD80、CD83、CD86等正性協(xié)同刺激分子，而PMSCs高表達(dá)PD-L1，HBMSCs則低水平表達(dá)PD-L1。(2)PMSCs可抑制T細(xì)胞體外增殖，并使PHA刺激下的T細(xì)胞滯留于細(xì)胞周期的G0/G1期，下調(diào)活化T細(xì)胞早期表面分子CD69的表達(dá)，以及調(diào)節(jié)IL-2、IFN-γ、IL-10的分泌。由此表明，PMSCs介導(dǎo)的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用部分是通過高表達(dá)PD-L1分子，PD-L1是PMSCs表達(dá)的主要