G6PD缺乏癥基因診斷新方法的建立及遺傳學(xué)分析.pdf

1、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是最常見的人類酶缺陷病之一，世界范圍內(nèi)約有4億人受累?；颊吲R床表現(xiàn)變化大，從無癥狀到新生兒黃疸、藥物或感染造成的急性溶血、蠶豆病和重癥慢性非球形細(xì)胞血溶性貧血，嚴(yán)重者導(dǎo)致新生兒期重癥核黃疸，造成死亡或永久性神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。該病的及早診斷和預(yù)防是我國優(yōu)生優(yōu)育工作的一個(gè)重要組成部分，檢測(cè)是否存在G6PD缺乏，給患者合理的忠告，避免使用可能引起溶血的藥物，合適處理由此引起的新生兒高膽紅素血癥，是該病的重

2、點(diǎn)。 本研究擬建立一種新的G6PD基因診斷方法，可以同時(shí)針對(duì)包括中國南方在內(nèi)的東南亞人群常見的10種點(diǎn)突變和1種多態(tài)性進(jìn)行基因分型。其工作原理是：利用DHPLC完全變性條件下，DNA雙鏈解開，依據(jù)Sanger的雙脫氧鏈終止原理，進(jìn)行引物延伸，即在突變位點(diǎn)前后設(shè)計(jì)引物，針對(duì)突變位點(diǎn)添加突變型雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)，當(dāng)引物與模板結(jié)合至突變位點(diǎn)時(shí)延伸終止。在DHPLC體系中，相同長度的單鏈DNA分子的保留時(shí)間與它們的堿基組成有

3、關(guān)，根據(jù)固定相對(duì)不同堿基的親和力，按照待分析片段3'端堿基C、G、A、T的次序進(jìn)行洗脫，從而分離單鏈DNA并檢測(cè)出已知突變。 全文小結(jié): 1、建立了用于G6PD缺乏中國人群常見基因突變PE/DHPLC分析方法。該方法具有十分明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)在該方法易于質(zhì)量控制，對(duì)照的設(shè)置及其特征性檢測(cè)圖譜對(duì)于操作者有很好的直觀提示作用；結(jié)果易于判讀，實(shí)驗(yàn)結(jié)果只需看相應(yīng)位置的峰的有無即可判定相應(yīng)突變的有無，并判定基因型；同時(shí)，該方法檢

4、測(cè)突變覆蓋廣，一次擴(kuò)增、兩步延伸可以同時(shí)對(duì)11種突變類型做出診斷；準(zhǔn)確、高效，大大提高發(fā)現(xiàn)稀有突變和新突變的可能性；經(jīng)濟(jì)、快捷，檢測(cè)一例標(biāo)本只需40元人民幣，一天可檢測(cè)65例標(biāo)本，為大型流行病學(xué)調(diào)查、臨床篩查提供有效手段。這一檢測(cè)模式的建立，大大提高了基因診斷水平，對(duì)G6PD研究起重要的推動(dòng)作用，同時(shí)該方法適用于檢測(cè)一個(gè)有限長度的基因片段中存在著突變熱點(diǎn)這樣的對(duì)象，也為其它人類遺傳性疾病的分子診斷提供借鑒。 2、首次全面分析了2

5、09例來自廣西柳州和廣東廣州地區(qū)的G6PD缺乏樣本的基因突變類型和基因型，發(fā)現(xiàn)11種點(diǎn)突變、1種多態(tài)性和1種中性突變，鑒定出30種已知突變基因型，包括一批首次報(bào)道的基因型。 3、檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1311多態(tài)性位點(diǎn)的樣本均伴發(fā)IVS1193T-C，推測(cè)這可能與致病性有關(guān)。 4、從基因型和表型關(guān)系入手，分析不同基因突變和基因型酶活性的不同，結(jié)果顯示半合子、雜合子、突變純合子G6PD/6PGD比值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，1024突變與95、13

6、88突變G6PD/6PGD比值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這對(duì)于指導(dǎo)G6PD的臨床分類和進(jìn)一步的分子診斷很有價(jià)值。 5、開展廣西柳州地區(qū)男性分子流行病學(xué)調(diào)查，提供了相對(duì)完整的G6PD缺乏癥基因突變、基因型以及表型資料，完善了地區(qū)基因突變譜，并為制訂地區(qū)G6PD缺乏癥的預(yù)防計(jì)劃提供有價(jià)值的參考。 本研究通過新的基因診斷方法的建立，克服了以往方法學(xué)的限制，為中國南方地區(qū)G6PD缺陷的診斷、預(yù)防提供新的篩查手段，并可積累有價(jià)值的中華民族基因