運(yùn)用細(xì)胞和多種分子遺傳學(xué)技術(shù)行丙二酰輔酶A脫羧酶缺乏癥病人的診斷.pdf

1、背景:丙二酰輔酶A脫羧酶(Malonyl Coenzyme A decarboxylase,MCD)缺乏癥(OMIM248360)是極其罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳代謝性疾病,亦稱丙二酸尿癥(malonic aciduria)。1984年Brown首報(bào)了該疾病,1999年K.A.Sacksteder,D.R.FitzPatrick,Jim Gao三人分別克隆了導(dǎo)致MCD缺乏癥的MLYCD基因,迄今為止,全世界共報(bào)導(dǎo)32例病例包括23種不同的基

2、因突變(見(jiàn)附表1),其臨床表現(xiàn)多變:常見(jiàn)有中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常如兒童早期智障,發(fā)育遲緩,癲癇,張力減退,腦部器質(zhì)性病變；腹瀉,嘔吐,肥厚型心肌病等,甚至導(dǎo)致新生兒死亡。其他少見(jiàn)癥狀有身材矮小,嗜睡,厭食,胃腸炎,聽(tīng)力障礙,面容畸形等。實(shí)驗(yàn)室檢查常見(jiàn)尿有機(jī)酸代謝異常(如丙二酰尿,甲基丙二酰尿),低血糖,代謝性酸中毒,酮癥酸中毒,乳酸血癥等。國(guó)內(nèi)暫無(wú)該疾病的研究報(bào)導(dǎo)。
　　 目的:運(yùn)用細(xì)胞和多種分子遺傳學(xué)方法對(duì)1例丙二酰輔酶A脫羧酶(M

3、CD)缺乏癥患者及其家系進(jìn)行研究,為患者及其家庭提供準(zhǔn)確的診斷和遺傳咨詢,為臨床上MCD缺乏患者的基因診斷提供指導(dǎo)。
　　 方法:
　　 ①對(duì)患者行尿有機(jī)酸代謝篩查；
　　 ②對(duì)患者行常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析；
　　 ③對(duì)患者及其父母外周血和患者皮膚gDNA.的MLYCD基因的5個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列行PCR擴(kuò)增并測(cè)序；
　　 ④對(duì)患者及其父母外周血和患者皮膚cDNA的MLYCD基因行PCR擴(kuò)增并測(cè)序；<

4、br>　　 ⑤對(duì)患者外周血gDNA行全基因組拷貝數(shù)基因芯片檢測(cè)；
　　 ⑥對(duì)患者及其父母外周血gDNA的MLYCD基因行MLPA檢測(cè)；
　　 ⑦對(duì)50個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體的外周血gDNA針對(duì)發(fā)現(xiàn)的MLYCD基因的新錯(cuò)義突變位點(diǎn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序；
　　 結(jié)果:
　　 1、患者尿有機(jī)酸代謝篩查結(jié)果:09年8月24日發(fā)現(xiàn)尿丙二酸增高；09年9月24日復(fù)查示尿丙二酸更增高,甲基丙二酸輕度增高；
　　 2、患者外

5、周血淋巴細(xì)胞染色體G帶、高分辨核型發(fā)現(xiàn)550-850條帶階段無(wú)異常。
　　 3、gDNA的MLYCD基因測(cè)序,患者存在c.920T>G(p.Leu307Arg)雜合錯(cuò)義突變,父親存在雜合錯(cuò)義突變c.920T>G(p.Leu307Arg)和雜合同義SNP(c.732G>A；p.ser266ser),母親存在雜合錯(cuò)義SNP(c.776G>C；p.Gly259Ala)；
　　 4、cDNA的MLYCD基因測(cè)序,患者存在純合父源

6、錯(cuò)義突變c.920T>G(p.Leu307Arg),母親存在純合錯(cuò)義SNP(c.776G>C；p.Gly259Ala),父親存在雜合錯(cuò)義突變c.920T>G(p.Leu307Arg)和雜合同義SNP(c.732G>A；p.ser266ser)；
　　 5、基因芯片顯示患者沒(méi)有微缺失微重復(fù)異常；
　　 6、MLPA技術(shù)示患者及母親gDNA的MLYCD基因皆存在Exonl雜合缺失,父親正常。
　　 7、新錯(cuò)義突變?cè)?

7、0個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體中未有發(fā)現(xiàn)。且通過(guò)與其他物種行序列同源比對(duì)(包括人,猩猩,牛,大鼠,小鼠),發(fā)現(xiàn)該錯(cuò)義突變位點(diǎn)皆為保守T。
　　 結(jié)論:
　　 1.患者父源MLYCD基因存在c.920T>G(p.Leu307Arg),為文獻(xiàn)未報(bào)導(dǎo)的新突變,該新突變位點(diǎn)在不同物種中皆保守。
　　 2.患者母源MLYCD基因存在Exon1缺失,且該鏈MLYCD基因不表達(dá)。
　　 3.確診患者為MLYCD基因復(fù)合雜合突變,導(dǎo)致丙二