中樞orexinA在針刺改善心肌缺血中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景:缺血性心肌病主要表現(xiàn)為心肌缺血或心肌梗死，隨著人民生活水平的提高及社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)壓力的增大，其發(fā)病率逐年上升并呈低齡化趨勢(shì)。如何找到一種能夠降低死亡率，改善心肌缺血及提高心肌梗死后心功能的治療方法成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，電針(EA)治療缺血性心肌病有其獨(dú)特的療效，而下丘腦（Hypothalamus）及延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateralmedulla, RVLM)作為心血管調(diào)控的中樞部位可

2、能參與其中，但其機(jī)制仍不是很清楚。1998年研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種新的下丘腦神經(jīng)肽—orexin，已報(bào)道其參與進(jìn)食行為、能量平衡及睡眠-覺(jué)醒的調(diào)節(jié)，我們對(duì)其心血管調(diào)節(jié)特別有興趣。近年研究證實(shí)，中樞活性氧(reactive oxygen species，ROS)參與交感興奮所致的心血管效應(yīng)。那么，中樞orexin是否參與了電針改善心肌缺血，而其調(diào)節(jié)作用是否與下丘腦和RVLM有關(guān)，中樞活性氧是不是介導(dǎo)了orexin對(duì)心肌缺血的調(diào)節(jié)作用，目前這些機(jī)

3、制仍不是很清楚。
　　目的:本課題通過(guò)建立急性心肌缺血(AMI)大鼠模型，觀察電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)急性心肌缺血的改善作用，檢測(cè)AMI組和AMI+EA大鼠心血管調(diào)節(jié)下丘腦外側(cè)區(qū)的OXA及RVLM的OX1R的表達(dá)，并觀察OXA阻斷劑、ROS的清除劑及NADPH氧化酶的抑制劑在RVLM對(duì)OXA引起心血管效應(yīng)的影響，同時(shí)檢測(cè)RVLM氨基酸的釋放改變，從而研究OXA調(diào)節(jié)中樞交感傳出的主要中樞部位，以及與其他心血管調(diào)節(jié)中樞遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)的關(guān)系，以分析or

4、exin調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)的作用途徑，進(jìn)一步探討電針改善心肌缺血的中樞機(jī)制。
　　方法:AMI大鼠模型采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備;大鼠針刺穴位選擇雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴，針刺對(duì)照穴位選擇雙側(cè)“列缺”穴;并監(jiān)測(cè)大鼠心率(HR)，平均動(dòng)脈壓(MAP)，心室內(nèi)壓(IVP)，觀察AMI大鼠及其針刺后心功能各項(xiàng)指標(biāo)的變化。采用氯化四唑(TTC)染色檢測(cè)梗死心肌面積、蘇木精和伊紅(HE)染色觀察梗死心肌組織形態(tài)以及超聲心動(dòng)圖觀察心臟的室壁結(jié)構(gòu)。采用心率

5、變異性(HRV)分析系統(tǒng)記錄大鼠心臟自主神經(jīng)功能狀態(tài)，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定各組大鼠血漿去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素(E)的含量。采用免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)各組（對(duì)照組、AMI組、AMI+EA內(nèi)關(guān)組）大鼠下丘腦外側(cè)區(qū)OXA和RVLM區(qū)OX1R的表達(dá);采用蛋白免疫印跡法(western blot)檢測(cè)各組（對(duì)照組、AMI組、AMI+EA內(nèi)關(guān)組）RVLM區(qū)OX1R蛋白的表達(dá)變化;采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Re

6、altime-PCR)觀察各組大鼠下丘腦prepro-orexin(PPO)的mRNA表達(dá)變化;采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定各組大鼠RVLM區(qū)ROS的含量變化;采用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察RVLM區(qū)OX1R與NADPH氧化酶亞單位p47phox及gp91phox的共表達(dá);采用中樞核團(tuán)RVLM微量注射的方法觀察OXA對(duì)心功能指標(biāo)的影響，及其阻斷劑SB-408124、ROS的清除劑Tempol及NADPH氧化酶的抑制劑Apocynin對(duì)OX

7、A心血管效應(yīng)的影響;采用微透析結(jié)合高效液相色譜熒光檢測(cè)技術(shù)(HPLC-FD)，觀察各組大鼠RVLM區(qū)氨基酸遞質(zhì)釋放的改變。
　　結(jié)果:
　　(1) AMI模型制備:冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后，大鼠立即出現(xiàn)心電圖S-T段抬高，結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌發(fā)白，運(yùn)動(dòng)減弱，說(shuō)明AMI模型制備成功。TTC及HE染色顯示AMI后梗死心肌組織及EA后的改善狀況，超聲心動(dòng)圖顯示AMI后左室內(nèi)徑增大室壁厚度變薄。
　　(2)心功能指標(biāo)監(jiān)測(cè):冠脈結(jié)扎5天

8、后，AMI大鼠心率(HR)加快，左室舒張末期壓力(LVEDP)升高，其他各項(xiàng)心功能指標(biāo)，包括左室收縮末期壓(LVSP)、左室壓力最大上升速率（+dp/dtmax）、左室壓力最大下降速率（-dp/dtmax）均顯著降低(P＜0.01，n=6)。電針AMI大鼠雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴后，其HR與LVEDP下降，其他各項(xiàng)心功能指標(biāo)也均有明顯改善(P＜0.01，n=6)。而電針AMI大鼠雙側(cè)“列缺”穴與電針“內(nèi)關(guān)”穴相比其心功能沒(méi)有得到改善(P＜0.05

9、或P＜0.01，n=6)。
　　(3)心率變異性(HRV)監(jiān)測(cè)及血清腎上腺素(E)與去甲腎上腺素(NE)含量測(cè)定:AMI大鼠HRV分析顯示，其LF/HF明顯升高，EA“內(nèi)關(guān)”后可降低LF/HF比值(P＜0.05，n=6); AMI大鼠血清中NE與E明顯增多(P＜0.05，n=6)，EA后兩者含量明顯降低。
　　(4)免疫組織化學(xué)(IHC)結(jié)果顯示，AMI大鼠HPO的OXA陽(yáng)性神經(jīng)元與RVLM的OX1R陽(yáng)性神經(jīng)元與對(duì)照組相比明

10、顯增多，包括相對(duì)光密度值及神經(jīng)元個(gè)數(shù)(P＜0.05，n=6)，EA“內(nèi)關(guān)”穴后兩部位的陽(yáng)性神經(jīng)元明顯減少(P＜0.05，n=6)，而EA“列缺”穴后兩部位陽(yáng)性神經(jīng)元與AMI組相比無(wú)明顯變化。
　　(5) western blot結(jié)果顯示，OX1R蛋白在各組大鼠RVLM均有表達(dá);與對(duì)照組相比，AMI組大鼠RVLM的OX1R蛋白表達(dá)明顯增多(P＜0.01，n=4)，EA后OX1R蛋白的表達(dá)可降低。
　　(6) real-time

11、 PCR結(jié)果顯示，各組大鼠下丘腦均有OXA表達(dá);AMI組大鼠下丘腦的PPO mRNA與對(duì)照組相比明顯增多(P＜0.01，n=7)，EA后可使其減少(P＜0.05，n=7)。
　　(7)激光共聚焦結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，RVLM區(qū)OX1R與NADPH氧化酶的胞膜亞單位gp91 phox及胞漿亞單位p47phox存在共表達(dá)
　　(8)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定ROS結(jié)果顯示，AMI大鼠RVLM區(qū)ROS含量與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05

12、，n=7），EA后可降低ROS的含量(P＜0.05，n=7)。AMI大鼠側(cè)腦室注射OXA(100pmol)后RVLM區(qū)ROS產(chǎn)生增多(P＜0.05，n=4)，注射SB(100pmol)、Tempol(50nmol)或Apo(5nmol)可阻斷這種效應(yīng)(P＜0.05或，n=4)。
　　(9)各組（對(duì)照組、AMI組、AMI+EA內(nèi)關(guān)組）大鼠RVLM微量注射OXA及阻斷劑SB后心功能變化顯示，OXA(100pmol)能使各組大鼠各心功能

13、指標(biāo)(HR、MAP、+dp/dtmax及-dp/dtmax)明顯升高，并且升高幅度在AMI大鼠更明顯。RVLM注射OXA抑制劑SB(100pmol)、Tempol(50nmol)或Apo(5nmol)能夠阻斷OXA引起的心血管效應(yīng)（P＜0.05或P＜0.01，n=7）。
　　(10)微透析結(jié)合HPLC結(jié)果顯示，AMI大鼠單側(cè)RVLM微量注射OXA(100pmol)，注射后第一、第二及第三個(gè)10minRVLM透析液中氨基酸含量與注射

14、前10min內(nèi)的相比，EAA谷氨酸(Glu)釋放增多(P＜0.05，n=6)，IAA甘氨酸(Gly)和?；撬?Tau)釋放減少;預(yù)先注射Tempol(50nmol)、Apo(5nmol)后再注射OXA，與單獨(dú)注射OXA相比，Glu釋放明顯減少（三者P＜0.05，n=6），Gly與Tau稍有增加。
　　結(jié)論:結(jié)扎大鼠冠脈左前降支可以成功制備AMI大鼠模型，其心功能明顯下降，繼發(fā)交感活性增強(qiáng);電針內(nèi)關(guān)穴可以增強(qiáng)AMI大鼠的心功能，降低

15、繼發(fā)的交感活性增強(qiáng)。這可能與中樞部位下丘腦外側(cè)區(qū)的OXA及RVLM的OX1R表達(dá)上調(diào)有關(guān)，并且AMI大鼠RVLM的活性氧釋放增多，NADPH氧化酶與OX1R在RVLM存在共表達(dá)，外源性O(shè)XA的心血管效應(yīng)可以被Tempol和APO阻斷，同時(shí)觀察到OXA可引起AMI大鼠RVLM區(qū)EAA-Glu增多，IAA-Gly/Tau減少，而Tempol及Apo可阻斷這一效應(yīng)。這都提示了針刺改善心肌缺血的機(jī)制之一是通過(guò)下調(diào)中樞OXA及OX1R，進(jìn)而降低N