甘氨酰tRNA合成酶調控奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成機理.pdf

1、乳蛋白合成的機理是重要的生命科學基礎問題之一，近年來的研究已有一些明顯的進展。目前，已發(fā)現(xiàn)催乳素通過JAK/STAT5信號通路在轉錄水平調控乳蛋白合成，氨基酸通過mTOR/S6K1信號通路在翻譯水平調控乳蛋白合成。但乳腺細胞內乳蛋白合成還有哪些重要的信號分子參與轉錄和翻譯調控，什么分子是氨基酸等營養(yǎng)素的“分子傳感器”，細胞核和細胞液之間的串話如何應答氨基酸信號從而調節(jié)乳蛋白的合成等，仍是現(xiàn)今泌乳生物學領域尚待解決的重要科學問題。本實驗較

2、系統(tǒng)全面的研究了甘氨酰tRNA合成酶作為一個新的信號分子，接受蛋氨酸信號，從轉錄水平和翻譯水平對奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白(CSN2)合成的調節(jié)作用及其機理。實驗既為人們弄清楚氨基酸對乳蛋白的調節(jié)及其作用機理提供基本理論依據，也為人們全面了解乳蛋白合成的網絡信號通路提供了一個新的視野。
　　本研究采用組織塊培養(yǎng)法，培養(yǎng)并純化體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞，用蛋白質免疫印記(WB)和免疫熒光(IF)檢測細胞中角蛋白18(CK18)和C

3、SN2的表達以鑒定細胞的純度和泌乳功能。實驗通過在培養(yǎng)液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸，建立了細胞的泌乳模型，用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、WB和IF等方法，檢測添加蛋氨酸泌乳模型中，GlyRS的表達與定位情況。結果表明，在蛋氨酸促進細胞泌乳時，GlyRS的表達顯著上升(p＜0.01)，并且GlyRS的入核也顯著增加(p＜0.01)。這說明，在蛋氨酸上調CSN2表達的過程中，GlyRS可能是一個重要的調節(jié)因子。
　　對

4、GlyRS進行過表達與干擾，利用qRT-PCR、WB和IF等方法檢測mTOR、p-mTOR、Stat5a、 p-Stat5a、S6K1、p-S6K1、4EBP1、p-4EBP1和CSN2的表達，用CASY細胞活力分析儀和流式細胞儀分析測定細胞活力、細胞數(shù)和細胞的增殖率。結果顯示，GlyRS過表達和干擾后，乳蛋白合成相關蛋白的磷酸化和CSN2均分別顯著上升和下降(p＜0.01)，細胞活力、細胞數(shù)和細胞的增殖率也分別顯著增加和減少(p＜0.

5、01)，而乳蛋白合成相關蛋白的非磷酸化形式無顯著變化(p＞0.05);添加蛋氨酸后，檢測的各蛋白的表達均顯著上升(p＜0.01)，但GlyRS干擾組，添加蛋氨酸不能使相關磷酸化蛋白和CSN2的表達恢復。這說明，GlyRS能接受蛋氨酸的信號，上調CSN2合成相關信號分子的磷酸化、促進CSN2的合成及細胞增殖，且蛋氨酸上調CSN2合成和促進細胞增殖的信號很大一部分是由GlyRS接受并傳遞的。
　　構建His-GlyRS載體與GlyRS

6、-His載體，提胞漿胞核蛋白，WB檢測GlyRS的入核及分子剪切。結果顯示，GlyRS在細胞中存在3種分子形式，在胞漿中為80-100kDa的全長形式，在胞核中在近N端剪切，剪切為為10-15kDa和60-80kDa的兩個分子形式。這說明，在GlyRS的入核過程中存在分子剪切，且剪切位點在N端。運用生物信息學手段分析GlyRS序列中可能的NLS序列，結果顯示，在GlyRS氨基酸序列中，有RKLK(79-82)和KARKR(99-103)

7、序列，基本符合NLS的經典通式K-(K/R)-X-(K/R)和R/K-X(10-12)-R-R-K-K，可能為GlyRS的NLS。用氨基酸點突變技術，將預測的NLS中的堿性氨基酸（R和K）分別突變成丙氨酸(A)，IF檢測氨基酸點突變后GlyRS的定位變化，結果表明RKLK(79-82)和KARKR(99-103)序列中任意一個堿性氨基酸（R和K）的突變均導致GlyRS不能入核。綜合上述結果說明，GlyRS在細胞中存在分子剪切，GlyRS

8、在細胞漿中為全長蛋白，在胞核中，在近N端斷開，剪切成10-15kda和60-80kda兩個片段。GlyRS序列中79-82、99-103這兩段序列是NLS。
　　用免疫共沉淀(Co-IP)、液質聯(lián)用質譜鑒定(L/MS)和激光能量共振轉移（FRET）等技術，鑒定胞漿中GlyRS的互作蛋白有113個，在胞核中GlyRS的互作蛋白有41個，并且在胞核中，GlyRS在544位蘇氨酸(T544)和704位絲氨酸(S704)處有磷酸化。胞漿互

9、作蛋白中，實驗選擇真核翻譯延長因子1A1(eEF1A1)和真核翻譯起始因子2D(eIF2D)作為目標蛋白繼續(xù)研究;胞核互作蛋白中，選擇核轉錄因子NFκB1作為目標蛋白繼續(xù)研究。應用定量免疫共沉淀和激光共聚焦共定位等技術，檢測添加蛋氨酸對GlyRS與eEF1A1、eIF2D和NFκB1互作的影響。結果顯示，添加蛋氨酸泌乳模型中，GlyRS與eEF1A1的結合顯著減少(p＜0.01)，與eIF2D、NFκB1的結合顯著增加(p＜0.01)。

10、對GlyRS進行過表達和干擾，WB檢測相關蛋白表達的變化。結果顯示，GlyRS過表達后，eIF2D、NFκB1和CSN2的表達顯著增加(p＜0.01)，eEF1A1的表達無顯著變化(p＞0.05); GlyRS干擾后，eIF2D、 NFκB1和CSN2的表達顯著下降(p＜0.01)，eEF1A1的表達無顯著變化(p＞0.05)。這說明，eIF2D和NFκB1可能參與GlyRS對CSN2合成的調節(jié)，而eEF1A1可能不參與此調節(jié)過程。對N

11、FκB1進行過表達，WB檢測相關蛋白表達的變化。結果顯示，NFκB1過表達后，CSN2的表達顯著增加(p＜0.01)。這說明，NFκB1對細胞中的CSN2的合成有正向調節(jié)作用。綜合上述結果說明，GlyRS在胞漿中與eIF2D結合，從翻譯水平上調CSN2的表達，在胞核中與NFκB1結合，從轉錄水平上調CSN2的表達。
　　根據質譜的磷酸化位點鑒定結果，突變GlyRS的磷酸化位點，IF檢測氨基酸點突變后GlyRS的定位變化，結果表明，

12、T544和S704任意一個位點突變成丙氨酸后，GlyRS均不能入核，這說明，GlyRS入核的機制可能如下:GlyRS接受蛋氨酸信號，T544和S704發(fā)生磷酸化，磷酸化的GlyRS由核引導序列引導入核。
　　應用染色質免疫共沉淀(CHIP)的方法，檢測GlyRS、NFκ1與CSN2啟動子的結合。結果顯示，GlyRS不與CSN2的啟動子結合，而NFκB1與CSN2的啟動子結合，其結合區(qū)域在CSN2轉錄起始位點上游的-1065～-15

13、43區(qū)間內。這說明，在蛋氨酸調節(jié)泌乳過程中，GlyRS入核后并不直接與CSN2啟動子結合，而是通過與NFκB1的互作，促進NFκB1與CSN2啟動子的結合來上調CSN2的表達。
　　綜上所述，GlyRS作為一個重要信號分子，能接受氨基酸（如蛋氨酸）信號，正向調節(jié)CSN2合成，其可能的調控機制如下:GlyRS接受氨基酸（如蛋氨酸）后，一部分在胞漿中與eIF2D結合，在翻譯水平上上調CSN2的表達，一部分在544位蘇氨酸和704位絲氨