負載供體凋亡脾細胞的受體耐受性樹突狀細胞延長協調性異種胰島移植物存活時間的實驗研究.pdf

1、隨著Edmonton方案的出臺，胰島移植已成為一種使1型糖尿病患者擺脫胰島素依賴的安全有效的治療方法，但該方案要求每個受者至少要接受2個以上供體的胰島才能恢復血糖正常，這更加劇了供體短缺，胰島來源有限已成為當前胰島移植的主要障礙。異種胰島有望改善胰島匱乏的局面，但其面臨強烈的反應，目前抑制排斥反應的常用方法就是大劑量的免疫抑制劑，但其為非特異性免疫抑制，有繼發(fā)感染、腫瘤的危險。誘導抗原特異性耐受是器官移植中的理想策略，也是當前的研究熱點

2、。異種胰島移植排斥反應主要由抗原識別“間接途徑”激活的T淋巴細胞所介導。樹突狀細胞(dendriticcell，DC)是唯一能夠激活初始T細胞反應的抗原遞呈細胞，在激發(fā)免疫應答或在誘導免疫耐受中DC起著樞紐作用，其功能主要與其成熟狀態(tài)有關。未成熟DC能有效提呈凋亡細胞抗原并轉向成熟。近期研究顯示，細胞因子信號抑制因子-1(suppressorofcytokinesignaling1，SOCS1)在抑制DC活化中起重要作用，因此，通過基因

3、轉染的方法上調SOCS1的表達能抑制DC成熟，維持其耐受原性。本研究中，我們用SOCS1基因修飾的受體DC負載供體凋亡脾細胞，然后于胰島移植前7天注入受體，觀察能否誘導T細胞耐受及延長異種胰島移植物存活時間，本研究分以下七部分： 第一部分：小鼠SOCS1基因重組腺病毒載體的構建、鑒定 目的：構建含小鼠SOCS1基因的重組腺病毒載體，并予以鑒定。 方法：以pEF-FLAG-1/mSOCS1質粒為模版，PCR擴增SO

4、CS1序列，PCR產物經AgeI和NheI酶切，再定向插入到AgeI和NheI酶切的pDC316-LacZa質粒中，獲得穿梭質粒pDC316-SOCS1，經PCR、AgeI和NheI酶切及測序等鑒定后，用脂質體將穿梭質粒pDC316-SOCS1與腺病毒骨架質粒pBHGF35共轉染293細胞，經位點特異性重組獲得含目的基因的重組腺病毒Ad5F35-SOCS1，行PCR鑒定，經293細胞擴增、純化制備高滴度病毒液，TCID50法測定病毒滴度

5、。 結論：成功構建了含小鼠SOCS1基因的重組腺病毒載體，為基因轉染制備耐受性樹突狀細胞奠定了基礎。 第二部分：小鼠骨髓源性樹突狀細胞體外培養(yǎng)及鑒定 目的:建立一種簡單經濟的體外擴增、培養(yǎng)小鼠骨髓源性樹突狀細胞(bonemarrowderiveddendriticcell，BM-DC)的方法，并從形態(tài)學、免疫表型和細胞功能方面予以鑒定。 方法：分離小鼠骨髓中DC前體細胞，用5ng/ml重組小鼠粒細胞.巨噬

6、細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)來擴增、培養(yǎng)小鼠BM-DC。培養(yǎng)體系分4天組和8天組組。培養(yǎng)第4天，收集疏松貼壁的細胞即為DC，用倒置顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察其形態(tài)特征，流式細胞儀分析其細胞表型，通過抗原吞噬實驗和混合淋巴細胞反應(MLR)來觀察其生物學功能。 結論:用rmGM-CSF體外誘導培養(yǎng)可獲得小鼠BM-DC。 第三部分：SOCS1基因轉染對小鼠樹突狀細胞生物學特性的影響 目的：研究SOCS1基

7、因轉染對小鼠樹突狀細胞生物學特性的影響。 方法：用攜帶小鼠SOCS1基因的重組腺病毒載體轉染小鼠DC，用免疫組化和Westernblot檢測DC中SOCS1的表達。用FCM檢測DCs的細胞表型變化，通過混合淋巴細胞反應(MLR)觀察DCs對T細胞增殖的影響，以ELISA檢測細胞因子分泌水平，實驗分為對照組、Ad-EGFP組、Ad-SOCS1組。 結論：SOCS1基因轉染能抑制DCs成熟，誘導T細胞向Th2方向分化，是制備

8、耐受性DCs的有效方法。 第四部分：SOCS1基因轉染小鼠樹突狀細胞負載大鼠凋亡脾細胞后的免疫特性研究 目的：研究SOCS1基因修飾的小鼠樹突狀細胞負載大鼠凋亡脾細胞后的免疫特性。 方法：用紫外線照射的方法來誘導大鼠脾細胞凋亡，FCM檢測細胞凋亡。將大鼠凋亡脾細胞(Apo-SCs)與SOCS1基因轉染的小鼠DC(SOCS1-DC)共培養(yǎng)48h，以使SOCS1-DC負載Apo-SCs(SOCS1-Apo-SCsDC

9、)。FCM檢測DC負載Apo-SCs前后共刺激分子的表達，通過初次MLR了解SOCS1-Apo-SCsDC刺激T細胞增殖的能力，用SOCSl-Apo-SCsDC預致敏小鼠后行再次MLR，觀察SOCS1-Apo-SCsDC能否誘導抗原特異性T細胞低反應性。 結論：SOCS1基因修飾的小鼠樹突狀細胞負載大鼠凋亡脾細胞后可誘導T細胞抗原特異性低反應性。 第五部分：大鼠胰島的分離、純化及鑒定 目的：對大鼠胰島分離、純化條

10、件進行優(yōu)化，為下一步胰島移植實驗奠定基礎。 方法：通過膽總管逆行灌注膠原酶P溶液來消化大鼠胰腺，分離胰島，采用不連續(xù)密度梯度Ficoll離心法純化胰島，觀察膠原酶濃度、消化時間對大鼠胰島分離結果的影響。雙硫腙染色鑒定胰島，丫啶橙/碘丙啶染色鑒定胰島細胞活率，糖刺激胰島素釋放試驗評價胰島功能。 結論：膠原酶濃度、消化時間影響胰島分離結果，優(yōu)化分離條件可改善大鼠胰島分離結果，1mg/ml膠原酶P靜止消化45分鐘條件下胰島分離

11、效果較好。第六部分糖尿病小鼠異種胰島移植模型的建立和療效觀察 第六部分：糖尿病小鼠異種胰島移植模型的建立和療效觀察 目的：建立糖尿病小鼠模型及大鼠對小鼠異種胰島移植模型，觀察異種胰島移植對小鼠糖尿病的療效。 方法：采用單次腹腔注射鏈脲霉素(200mg/kg)來制備糖尿病小鼠模型，以非空腹血糖連續(xù)超過16.7mmol/L視為造模成功。將600個大鼠胰島移植到糖尿病小鼠腎被膜下，觀察異種胰島移植物的功能，以非空腹血糖

12、連續(xù)超過11.2mmol/L視為移植物被排斥，功能喪失，并通過組織病理學觀察異種胰島移植物形態(tài)學的變化。 結論：成功建立糖尿病小鼠異種胰島移植模型，為研究異種胰島移植排斥或耐受奠定了基礎。 第七部分：SOCS1基因修飾的受體樹突狀細胞負載供體凋亡細胞延長協調性異種胰島移植物存活的實驗研究 目的：探討負載供體凋亡脾細胞的受體耐受性樹突狀細胞在誘導協調性異種胰島移植耐受中的作用。 方法：建立Lewis大鼠對C

13、57BL/6小鼠腎被膜下異種胰島移植模型。胰島移植前7天經尾靜脈輸注2×106個不同方法處理的受體DC來預處理受體小鼠，據輸注DC的不同將實驗分為6組：①對照組：單純注射磷酸鹽緩沖液；②DC組：單純受體DC；③SOCS1-DC組：SOCS1基因轉染的受體DC：④Apo-SCsDC組：負載供體凋亡脾細胞(Apo-SCs)的受體DC；⑤SOCS1-Apo-SCsDC組：負載供體Apo-SCs且已轉染SOCS1基因的受體DC；⑥無關第三供體組

14、：SD大鼠為供體，余處理同第5組。觀察各組胰島移植物存活時間及組織病理學改變，非空腹血糖低于11.2mmol/L視為血糖正常，血糖連續(xù)2天高于11.2mmol/L視為移植物排斥，功能喪失。 結論：SOCS1基因修飾的受體DC負載供體凋亡脾細胞可延長協調性異種胰島移植物存活時間。 總結：轉染SOCS1基因能抑制DC成熟，SOCS1基因修飾的受體DC負載供體凋亡脾細胞可誘導T細胞抗原特異性低反應性，并能延長協調性異種胰島移植