造血干細胞體內(nèi)衰老模型的構(gòu)建及相關(guān)生物學研究.pdf

1、目的：
　　 生、老、病、死是生命的自然規(guī)律。衰老是機體發(fā)育成熟以后伴隨著時間的推移體內(nèi)各種細胞、組織與器官逐漸發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能不可逆轉(zhuǎn)的、全面的衰退過程。最新研究認為：生物體的衰老實際上是其體內(nèi)干細胞的衰老，所有的衰老現(xiàn)象包括組織器官退化、功能喪失、腫瘤發(fā)生和反復(fù)感染等都是成體干細胞衰老水平的具體表現(xiàn)。因此，深入研究干細胞衰老的機理對預(yù)防和治療老年性疾病有重要理論意義與臨床應(yīng)用價值。
　　 實驗證明，造血干細胞（HSC）

2、的衰老與機體衰老有著密切的關(guān)系。HSC衰老是指細胞生長停滯，不可逆的停留在GI期，自我更新和多向分化能力降低，細胞數(shù)量減少，應(yīng)激性凋亡升高。HSC衰老可以引起機體造血功能和免疫功能的衰退、腫瘤發(fā)生率增加，并導致機體重要臟器結(jié)構(gòu)與功能的衰退。目前對HSC衰老機理還了解甚少，如果能闡明HSC衰老的生物學機理，尋找到延緩其衰老途徑，無疑對防治老年性疾病有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。衰老模型的構(gòu)建與相關(guān)生物學檢測是研究HSC衰老機理的重要基礎(chǔ)

3、性工作，迄今仍未見理想和公認的HSC體內(nèi)衰老模型。本研究以C57小鼠為研究對象，采用雄性供體HSC連續(xù)性移植建立小鼠的HSC復(fù)制性衰老的體內(nèi)模型，并通過整體、細胞和分子水平對HSC衰老的生物學特性進行檢測，旨在為研究HSC衰老機理以及延緩其衰老的途徑提供理論與實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.免疫磁性分選法（MACS）分離、純化雄性C57小鼠Sca-1+HSC，流式細胞術(shù)（FCM）鑒定分選細胞純度，免疫熒光檢測分選HS

4、C Sca-1+抗原的表達，臺盼藍拒染法檢測分選Sca-1+HSC的活性。
　　 2.用雄性供體HSC連續(xù)尾靜脈移植給雌性受體鼠，建立小鼠HSC復(fù)制性衰老體內(nèi)模型；經(jīng)PCR分析Y染色體基因，鑒定受體鼠造血細胞是否來源于雄性供體；觀察移植后受體鼠脾結(jié)節(jié)（CFU-S）形成數(shù)量、測定脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù)，觀察移植HSC后受體鼠外周血血象指標（WBC，RBC以及PLT）的恢復(fù)，以觀察受體鼠造血功能重建情況。
　　 3.采用造血祖細

5、胞混合性集落（CFU-Mix）培養(yǎng)、細胞周期測定和衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β）染色，觀察連續(xù)移植所致衰老HSC自我更新和多向分化能力的生物學特點。
　　 結(jié)果：
　　 1.小鼠Sca-1+HSC分離純化及鑒定
　　 流式細胞術(shù)檢測MACS前骨髓單個核細胞（MNCs）中Sca-1+HSC百分比僅為1.7％；MACS分離純化后Sca-1+HSC純度可達87.2％以上。免疫熒光觀察顯示，分選前MNCs中僅有極少數(shù)

6、細胞表達Sca-1+抗原，MACS分離純化后標記的細胞中見大多數(shù)細胞表達Sca-1+抗原。臺盼藍拒染法檢測分選的Sca-1+HSC活性為96％～99％。提示分選的Sca-1+細胞有較高純度和活性。
　　 2.供體HSC連續(xù)移植后受體鼠脾結(jié)節(jié)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及外周血
　　 血象檢測
　　 2.1雄性供體HSC連續(xù)移植2次后，其在受體小鼠脾臟上形成CFU-S的能力下降。
　　 2.2雄性供體HSC連續(xù)移植

7、2次后，受體小鼠的脾臟和胸腺重量減輕，脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)皆有明顯下降。
　　 2.3雄性供體HSC連續(xù)移植2次后，受體小鼠WBC，RBC、PTC以及HCT均有所降低，提示在連續(xù)移植中HSC的自我更新及重建造血的能力下降。
　　 3.Y染色體檢測
　　 經(jīng)Y染色體PCR分析，結(jié)果顯示受體鼠的造血細胞均能檢測出342bp的Y染色體序列（Sry序列），證明雌性受體小鼠重建造血的細胞來源于雄性供體小鼠HSC。
　　

8、 4.連續(xù)移植所致HSC衰老的生物學檢測
　　 4.1隨著HSC連續(xù)移植代數(shù)的增加，其形成CFU-Mix集落數(shù)量和形成集落的細胞數(shù)明顯降低。
　　 4.2隨著HSC連續(xù)移植代數(shù)的增加，細胞出現(xiàn)G1期阻滯，其G0/G1期比例明顯增高，S期比例減少。
　　 4.3隨著HSC連續(xù)移植代數(shù)的增加，SA-β-半乳糖苷酶陽性細胞百分比明顯增高。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用MACS能成功、有效的分離、純化雄