靶向OPN基因的RNA干擾對膀胱癌T24細胞生物學行為的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　 第一部分 RNA干擾OPN基因的慢病毒載體的構建及鑒定
　　 目的:構建并制備攜帶靶向shRNA-OPN基因的慢病毒載體。
　　 方法:根據(jù)OPN的基因序列設計四條siRNA作為RNA干擾靶點，分別構建4個shRNA質粒表達載體并通過PCR和測序進行鑒定。經鑒定正確后分別轉染293T細胞，采用Western blot檢測目的蛋白的表達情況，進而判斷不同靶點的干擾效果。選取最

2、有效的靶點包裝OPN-RNAi慢病毒。對所獲病毒載體進行鑒定分析和滴度測定。
　　 結果:構建的質粒表達載體經PCR鑒定均可擴增出預期條帶，測序證明質粒構建成功。Western blot顯示KD1，KD2，KD3，KD4靶點對目的基因的表達都有顯著敲減作用，逐孔稀釋滴度測定法測定shRNA-OPN病毒滴度約為2×109TU/ml。
　　 結論:成功制備了OPN-shRNA慢病毒載體。
　　 第二部分 OPN-sh

3、RNA對人膀胱癌（T24細胞）生物學行為影響的體外研究
　　 目的:觀察由慢病毒攜帶的OPN-shRNA對體外培養(yǎng)的人膀胱癌的抑制作用。
　　 方法:將OPN-shRNA轉染入人膀胱癌T24細胞株中，并測定轉染效率。PCR、Western blot檢測OPN mRNA和蛋白表達，MTT法檢測干擾組（OPN-RNAi組）增殖能力，流式細胞儀檢測周期，Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡，Transwell小室

4、檢測其侵襲能力。
　　 結果:OPN-shRNA被成功地轉染入T24細胞中，轉染效率在90％以上。與陰性對照組和空白對照組比較，干擾組（實驗組）OPN細胞的mRNA表達明顯受到抑制，同樣的結果見于蛋白表達的檢測中。同時，干擾組細胞增殖能力下降，凋亡率增高、侵襲能力下降。
　　 結論:在體外，OPN-shRNA能抑制人膀胱癌T24細胞株的OPN基因表達，并能抑制細胞增殖，促進凋亡，抑制侵襲轉移能力。
　　 第三部分

5、 OPN-shRNA對人膀胱癌(T24細胞)生物學行為影響的體內研究
　　 目的:在整體水平研究OPN-shRNA對T24生長、轉移和浸潤行為的抑制作用。
　　 方法:建立人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型。在皮下模型中，按500ug標準在瘤內分別注射OPN-shRNA，陰性對照shRNA病毒，等量生理鹽水觀察抑瘤效果，S-P法檢測OPN、VEGF蛋白表達。
　　 結果:干擾組皮下移植瘤生長明顯受抑制，體積和重量明顯小于