NNMT過(guò)表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及意義研究.pdf

1、為了降低腫瘤的死亡率或提高治療的效果，許多研究致力于腫瘤關(guān)鍵生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和篩選?；蚪M和蛋白組學(xué)等新技術(shù)的應(yīng)用為篩選新的腫瘤標(biāo)志物或耐藥相關(guān)分子提供了新的途徑。尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT, EC2.1.1.1)正是近年用蛋白組學(xué)和基因芯片技術(shù)比較不同癌組織和癌旁組織差異時(shí)發(fā)現(xiàn)的在癌組織中異常表達(dá)的蛋白質(zhì)酶。與正常組織和腫瘤旁組織相比，NNMT在結(jié)直腸癌、甲狀腺乳頭狀癌、腎透明細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、膀胱癌、胃和胰腺等腫瘤

2、組織有過(guò)表達(dá)，并在多種腫瘤患者的血清中升高。這些研究提示NNMT與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，推測(cè)NNMT可能參與腫瘤細(xì)胞的多種生物功能，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，或可影響化、放療效果，但對(duì)NNMT在腫瘤細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)的意義或確切作用仍需細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
　　 鑒于大腸癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，大腸癌死亡率僅次于肺癌居第二位，在我國(guó)的惡性腫瘤死因順位中居第三、四位，是我國(guó)現(xiàn)階段重點(diǎn)防治的8大癌癥之一，并具有高發(fā)趨勢(shì)

3、，我們選擇該腫瘤為本次研究的重點(diǎn)。
　　 目的：研究NNMT對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響；研究NNMT在腫瘤中的作用機(jī)制或分析其下游相關(guān)分子組成的模塊或通路，NNMT與結(jié)直腸癌臨床病理的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒p GEX-4T-2/NNMT和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/NNMT。
　　 2.利用基因工程制備N(xiāo)NMT蛋白，并作為免疫原免疫小鼠制備N(xiāo)NMT單克隆抗

4、體，并建立基于此單克隆抗體的Western-blot、免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法。
　　 3.采用RT-PCR和Westem-blot分析多株結(jié)直腸癌細(xì)胞系的NNMT表達(dá)，篩選NNMT無(wú)/低表達(dá)和高表達(dá)株。
　　 4.把pcDNA3.1/NNMT轉(zhuǎn)入COLO320和SW480細(xì)胞株，用G418來(lái)篩選轉(zhuǎn)入目的基因的細(xì)胞，建立相應(yīng)的NNMT高表達(dá)腫瘤細(xì)胞模型和空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的對(duì)照模型。
　　 5.通過(guò)NNMT高表

5、達(dá)腫瘤細(xì)胞模型，結(jié)合RNA干擾技術(shù)，MTT法分析NNMT對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和化療藥物敏感試驗(yàn)、流式細(xì)胞儀分析凋亡和細(xì)胞周期、用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel基質(zhì)浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)研究NNMT對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵潤(rùn)等生物學(xué)功能的影響。
　　 6.用Affimetrix gene expression芯片比較NNMT基因?qū)肭昂蟠竽c癌細(xì)胞的基因表達(dá)差異，分析NNMT下游效應(yīng)分子和作用機(jī)制。
　　 7.采用免疫組化檢測(cè)組

6、織NNMT與結(jié)直腸癌的臨床病理的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1.構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒p GEX-4T-2/NNMT和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/NNMT,并通過(guò)了酶切和測(cè)序驗(yàn)證。
　　 2.利用基因工程制備的NNMT蛋白作為免疫原免疫小鼠制備了能穩(wěn)定分泌抗NNMT單克隆抗體的4個(gè)細(xì)胞株，該NNMT單克隆抗體具有很好的特異性和反應(yīng)性，并建立了基于此單克隆抗體的Western-blot、免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法。
　　 3.對(duì)多株

7、大腸癌細(xì)胞系的NNMT的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行了分析，RT-PCR結(jié)果顯示除SW480外，其余細(xì)胞均能檢測(cè)到mRNA，其中COLO320表達(dá)水平最高。Western blot結(jié)果也顯示NNMT蛋白在COLO320細(xì)胞株表達(dá)量最高，其次為HCE8693和HT-29，SW480細(xì)胞株表達(dá)陰性，SW620、HCT116細(xì)胞株表達(dá)較弱。
　　 4.建立了相應(yīng)的NNMT高表達(dá)腫瘤細(xì)胞模型和空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的對(duì)照模型。 pcDNA

8、3.1/NNMT轉(zhuǎn)染SW480組NNMT mRNA水平較對(duì)照大幅上升，且轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/NNMT的SW480細(xì)胞NNMT蛋白表達(dá)陽(yáng)性，而對(duì)照細(xì)胞陰性，提示NNMT基因?qū)氤晒?，并有效表達(dá)；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/NNMT的COLO320細(xì)胞的NNMT蛋白表達(dá)較對(duì)照組高約1.621倍，也表明NNMT基因?qū)氤晒?，并有效表達(dá)。
　　 5.MTT法檢測(cè)了NNMT對(duì)細(xì)胞增殖的影響：從第72小時(shí)開(kāi)始，轉(zhuǎn)染NNMT基因的細(xì)胞株的490n

9、m波長(zhǎng)處光吸收值高于對(duì)照組，經(jīng)方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。直接選擇SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司的NNMT siRNA(m):sc-61214，在SW480細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/NNMT和空載體的SW480細(xì)胞進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染NNMT基因的細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖能力高于對(duì)照組，但可被NNMT特異的siRNA抑制。
　　 6.MTT法檢測(cè)NNMT對(duì)5-FU和奧沙利鉑的影響。結(jié)果導(dǎo)入NN

10、MT SW480細(xì)胞株對(duì)5-Fu耐藥性較對(duì)照組細(xì)胞株強(qiáng)，SW480-pcDNA3.1/NNMT cell的IC50為16.8 mM，SW480-pcDNA3.1和SW480的IC50為8.8，9.2 mM;對(duì)奧沙利鉑耐藥性變化不大。
　　 7.對(duì)NNMT轉(zhuǎn)染前后SW480細(xì)胞進(jìn)行了Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel基質(zhì)浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SW480細(xì)胞和空載體SW480細(xì)胞幾乎無(wú)細(xì)胞穿過(guò)，而pcDNA3.1/NN

11、MT的SW480細(xì)胞則約有15-30個(gè)每低倍視野。
　　 8.細(xì)胞周期結(jié)果顯示SW480細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/NNMT和空載體的SW480細(xì)胞三組間G1期、G2期和S期的比例差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在COLO320，COLO320-pcDNA3.1，COLO320-pcDNA3.1/NNMT細(xì)胞三組細(xì)胞也得到了同樣的結(jié)果。
　　 9.細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞組用5-FU的處理誘導(dǎo)24h后的凋亡變化顯示SW48

12、0-pcDNA3.1/NNMT細(xì)胞的LR\細(xì)胞數(shù)為9.12％，低于對(duì)照組15.66％、15.85％，提示NNMT具有抗凋亡功能。COLO320細(xì)胞組的凋亡分析結(jié)果也顯示NNMT具有抗凋亡功能，COLO320-pcDNA3.1/NNMT細(xì)胞的LR（右下象限）細(xì)胞數(shù)為8.90％，低于對(duì)照組11.44％、12.57％，UR區(qū)（右上象限）的FITC+/PI+壞死細(xì)胞沒(méi)有明顯差別。
　　 10.我們用Affimetrix gene exp

13、ression芯片比較NNMT基因?qū)肭昂蟠竽c癌細(xì)胞株SW480基因表達(dá)差異，根據(jù)pcDNA3.1/NNMT的SW480細(xì)胞/SW480細(xì)胞，或pcDNA3.1/NNMT的SW480細(xì)胞/空載體的SW480細(xì)胞的基因表達(dá)差異超過(guò)2，同時(shí)考慮空載體的SW480細(xì)胞/SW480細(xì)胞，共選出33個(gè)候選基因。對(duì)上述基因進(jìn)行GO功能分析發(fā)現(xiàn)具有差異表達(dá)的基因主要與物質(zhì)代謝（脂類(lèi)、糖）、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞分化相關(guān)。其中

14、上調(diào)的基因主要參與脂類(lèi)代謝、氧化還原和電子傳遞。
　　 11.對(duì)109例原發(fā)灶、26例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織進(jìn)行了NNMT免疫組化分析，18例(16.5％)原發(fā)灶的腫瘤組織陽(yáng)性，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織全陰性；陽(yáng)性反應(yīng)主要在腫瘤組織的細(xì)胞漿，高分化、低分化和黏液腺癌組織均有病例顯示陽(yáng)性，癌旁的正常組織陰性，NNMT在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)與病人的臨床病理因素的相關(guān)分析顯示：NNMT的陽(yáng)性率與腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)，在低分化腺癌中的陽(yáng)

15、性率為36.4％，高于高中分化腺癌(7.9％)，P＜0.01；NNMT的陽(yáng)性率在不同年齡、性別、腫瘤的部位、TNM分期、DUKE'S分期組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.從正常人肝臟組織中獲得NNMT基因，并構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2/NNMT和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/NNMT；構(gòu)建了SW480-pcDNA3.1，SW480-pcDNA3.1/NNMT，COLO320-pcDN

16、A3.1和COLO320-pcDNA3.1/NNMT等細(xì)胞模型；利用基因工程制備的NNMT蛋白可作為免疫原免疫小鼠制備抗體、作為反應(yīng)抗原建立ELISA或Western-Blot的陽(yáng)性對(duì)照；制備了國(guó)內(nèi)首株能穩(wěn)定分泌抗NNMT單克隆抗體的細(xì)胞株，并建立了基于此單克隆抗體的Western-blot、免疫組化等實(shí)驗(yàn)方法，為研究NNMT提供了很好的工具。
　　 2.不同大腸癌細(xì)胞系的NNMT的mRNA和蛋白表達(dá)不一，COLO320細(xì)胞株表

17、達(dá)量最高，而SW480細(xì)胞株表達(dá)陰性。NNMT與結(jié)直腸癌的臨床病理分析顯示NNMT的陽(yáng)性率與腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)，陽(yáng)性的NNMT主要在低分化腺癌。NNMT的陽(yáng)性率在不同年齡、性別、腫瘤的部位、TNM分期、DUKES分期組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NNMT的陽(yáng)性反應(yīng)主要在腫瘤組織的細(xì)胞漿，這符合NNMT是胞漿酶的定位。NNMT對(duì)腫瘤的遷移和侵潤(rùn)的影響，臨床病理結(jié)果和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一致，需進(jìn)一步研究。
　　 3.細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯

18、示NNMT可能與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能密切相關(guān)：NNMT能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，NNMT量的提高也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；NNMT能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力；NNMT能通過(guò)某種途徑抗凋亡；NNMT可能影響腫瘤細(xì)胞耐藥。
　　 4.共選出33個(gè)候選基因，這些具有差異表達(dá)的基因主要與物質(zhì)代謝（脂類(lèi)、糖）、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞分化相關(guān)。其中上調(diào)的基因主要參與脂類(lèi)代謝、氧化還原和電子傳遞。我們推測(cè)NNMT可通過(guò)細(xì)胞