miR-1826在大腸癌中的表達和臨床意義及其對SW480細胞生物學(xué)行為影響的實驗研究.pdf

1、目的:檢測miR-1826在大腸癌患者中的表達情況并分析其在對臨床相關(guān)性。同時,通過miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染干擾大腸癌SW480細胞中miR-1826的表達,觀察其對大腸癌細胞增殖、周期、凋亡及侵襲遷移的影響,探討miR-1826在大腸癌中的生物學(xué)作用,進一步分析其潛在靶基因,為大腸癌的靶向基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1、收集大腸癌患者標本72例,同時收取癌組織及相應(yīng)的癌旁組織。通過SYBR GREEN熒光定量PCR(

2、qRT-PCR)檢測各組織中miR-1826的表達水平。培養(yǎng)五株大腸癌細胞株,采用qRT-PCR方法篩選出miR-1826高表達細胞株SW480,備后續(xù)實驗使用。2、通過生存分析探究miR-1826在大腸癌中表達跟患者預(yù)后的關(guān)系,并分析miR-1826表達水平跟臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,在通過單因素及COX多因素分析討論miR-1826在大腸癌中預(yù)后影響的獨立性。3、以脂質(zhì)體(lipofectamineTM2000)為載體將帶熒光標記的mi

3、RNA inhibitor轉(zhuǎn)染SW480細胞并用流式細胞儀檢測從而篩選出最佳轉(zhuǎn)染條件。設(shè)計制備針對miR-1826的3組不同inhibitor序列,以最佳轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染細胞后采用qRT-PCR驗證干擾效果并進而篩選出最佳干擾片段以備后續(xù)實驗用。4、將先前篩選出的最佳干擾片段miR-1826inhibitor按最佳轉(zhuǎn)染條件對miR-1826高表達細胞株SW480進行轉(zhuǎn)染干擾,再分別采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法,流式細胞術(shù)(FCM),侵襲實

4、驗,遷移實驗檢測inhibitor干擾miR-1826后對大腸癌SW480細胞增殖,凋亡、周期及侵襲、遷移性的影響。
　　結(jié)果:1.癌旁組織中miR-1826的表達水平明顯低于腫瘤組織(P<0.001)。miR-1826在5株結(jié)直腸癌細胞中均有不同程度的表達,在SW480細胞株中表達水平最高。2.生存分析顯示高表達的miR-1826跟大腸癌患者預(yù)后負相關(guān)(P<0.05),并跟大腸癌的不良預(yù)后指標如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.018)和TM

5、N分期(P=0.004)正相關(guān)。COX線性回歸分析顯示miR-1826表達為大腸癌中一項獨立的預(yù)后影響因素(P=0.043)。3.細胞數(shù)約為每孔1.5×105個、inhibitor濃度約為80pmol,Lipofectamine20與inhibitor比例為6ul:8ul(6孔板)時,有較佳的轉(zhuǎn)染效率,繼續(xù)提高inhibitor濃度并不能明顯提高轉(zhuǎn)染效率。將三組inhibitor轉(zhuǎn)染細胞后miR-1826表達量均有不同程度下降,其中以m

6、iR-1826 inhibitor2干擾效果最明顯,轉(zhuǎn)染細胞后miR-1826表達水平明顯下降。4.轉(zhuǎn)染了miR-1826inhibitor的大腸癌細胞SW480細胞株吸光度值降低,增殖活力下降,生長緩慢,細胞凋亡增加,且大部分停留在G0/G1期,同時,細胞的侵襲和遷移性減低。
　　結(jié)論:miR-1826在大腸癌中高表達,且跟大腸癌患者生存時間負相關(guān),并為大腸癌中一項獨立的預(yù)后影響因素。轉(zhuǎn)染miRNA inhibitor能使miR