乙型肝炎病毒X基因變異與cccDNA的檢測及臨床意義.pdf

1、背景：
　　乙型肝炎病毒(HBV)變異株是病毒基因堿基序列與同型的代表株或共有序列比較有獨(dú)特的變化。HBV的DNA多聚酶由于在DNA復(fù)制過程中缺乏校正功能,具有較高突變率。在慢性感染者中,HBV持續(xù)承受宿主巨大的免疫壓力,更易發(fā)生變異,但大多數(shù)變異并無實(shí)際意義;若變異發(fā)生在重要功能的區(qū)段內(nèi),影響了病毒蛋白質(zhì)的合成和結(jié)構(gòu),可使變異的病毒逃避免疫監(jiān)控,大量復(fù)制增殖,致病性增強(qiáng),導(dǎo)致乙肝慢性化、重癥化及致癌化。既往重點(diǎn)對HBV基因組、P

2、基因區(qū)、前C及C區(qū)的變異研究,而位于HBV基因前C/C區(qū)上游約200bp左右的X區(qū)(nt1374-nt1838)是目前研究的熱點(diǎn),其含有基本核心啟動(dòng)子(Base Core Promoter,BCP)、核心上游調(diào)節(jié)序列(Core Upstream Regulation Sequences,CURS)、負(fù)性調(diào)節(jié)元件(Negative Regulation Element,NRE)、增強(qiáng)子Ⅱ(Enhancer,EnhⅡ)和直接重復(fù)序列(Dir

3、ect Repeatsequence,DR)1,2等重要的基因表達(dá)調(diào)控元件,編碼154個(gè)氨基酸殘基的X蛋白,具有廣泛的反式激活作用,在HBV的復(fù)制和表達(dá)中起重要作用。因此,據(jù)上述推測,HBVX基因變異對HBV復(fù)制及乙肝患者病程進(jìn)展起著重要影響。
　　目的：
　　研究HBVX基因變異對HBV復(fù)制情況、乙肝患者病程進(jìn)展、肝功能的影響及與HBV基因型的關(guān)系,為臨床治療乙肝患者及監(jiān)測病情進(jìn)展提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　

4、　根據(jù)2005年病毒性肝炎防治方案診斷標(biāo)準(zhǔn),將168例乙肝患者分為乙型肝炎攜帶者為29例,慢性乙型病毒性肝炎為70例,肝炎肝硬化31例,乙肝肝癌38例。所有入選患者以無菌操作取新鮮血液4ml。標(biāo)本離心后分離血清置EP管,放入-70℃低溫冰箱保存。采用PCR-HRM分析技術(shù)檢測血清HBVX基因變異情況;直接測序(或克隆測序)確認(rèn)變異位點(diǎn);利用NCBI網(wǎng)站上的genotypetool確定HBV基因型;ELISA檢測HBV血清標(biāo)志物;采用日立

5、7600型全自動(dòng)生化分析儀檢測肝功能指標(biāo)(ALT、AST、ALB及TBIL);放射免疫技術(shù)檢測肝纖維化指標(biāo)(HA、LN、IV-C及PIIIP)。
　　結(jié)果：
　　1.采用PCR-HRM分析技術(shù)能很好地區(qū)分基因不同位點(diǎn)突變。168例乙肝患者血清HBVX區(qū)段突變檢出率前五位的位點(diǎn)是nt1764(72.6％)、nt1719(68.5%)、nt1762(67.8%)、nt1727(54.2%)、nt1726(37.5%)及nt173

6、0(37.5%)。
　　2.HBVX基因變異與血清肝臟功能指標(biāo)無顯著性關(guān)系(p>0.05,t檢驗(yàn))。在HCC病例組里,BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異與層粘連蛋白(LN)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　3.HBeAg陰性組BCP雙變異(nt1762A→T/1764G→A)聯(lián)合CP聚集變異(nt1719T→C/1726A→C/1727A→T/1730C→G)、nt1755A-C/nt1768T-A雙變異的檢出率均顯著高

7、于HBeAg陽性組(p<0.05)。
　　4.HBVDNA高水平(105copies/ml≤HBVDNA)BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異、nt1755A-C/nt1768T-A雙變異的檢出率均顯著高于HBVDNA低水平組(103copies/ml≤HBVDNA<1×105copies/ml)(p<0.05)。
　　5.HBVC基因型中BCP雙變異、CP聚集變異、BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異及nt1755A-C/nt1768T-

8、A發(fā)生率均較B基因型高(p<0.05)。
　　6.BCP雙變異聯(lián)合CP聚集變異和nt1755A→C/nt1768A→G雙變異檢出率隨著乙肝病程進(jìn)展有升高的趨勢,在乙肝肝癌組中檢出率最高。
　　結(jié)論：
　　1.PCR-HRM分析在HBV基因突變檢測中是一種較新的技術(shù),但此技術(shù)對所檢測樣本要求較高,可能影響其在臨床的廣泛使用。
　　2.nt1755A→C/nt1768A→G雙變異是除BCP雙變異外新的雙位點(diǎn)聯(lián)合突變。