慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血造血干細胞生物學活性及其臨床應用前期研究.pdf

1、干細胞因其具有自我更新及多向轉(zhuǎn)化的功能，已被廣泛應用于細胞替代治療、基因治療及組織工程。肝衰竭是威脅人類生命的嚴重疾病，并發(fā)癥多，病死率高，治療仍是世界難題。干細胞治療在肝衰竭領域的應用也越來越多地受到人們的關(guān)注。
　　目的:研究慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血造血干細胞的生物學活性，及其促進肝損傷修復、改善肝功能的可能機制;進一步探討機體內(nèi)環(huán)境的改變對其功能的影響。
　　方法:本研究自慢加急性（亞急性）肝衰竭患者及健康志

2、愿者外周血分離CD34+細胞，通過觀察細胞形態(tài)、記錄細胞生長曲線、檢測細胞周期及細胞凋亡情況，了解其生物學活性;通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中細胞因子HGF、MMP-9、TNF-α、IL-6，RT-PCR檢測細胞表面標志丙酮酸激酶M2(PK-M2，未成熟肝細胞表面標志)、整聯(lián)蛋白β1（Integrin-β1，肝細胞發(fā)育過程中細胞表面標志），L型丙酮酸激酶同功酶（L-PK，成熟肝細胞表面標志）的表達，免疫熒光檢測細胞表面標志Integri

3、n-β1的表達，探究外周血CD34+細胞在肝病患者體內(nèi)修復損傷肝臟的可能機制;采用含慢加急性（亞急性）肝衰竭患者血漿置換前后血清的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)患者外周血CD34+細胞，通過比較兩組細胞的生長曲線，及RT-PCR檢測細胞表面標志PK-M2、Integrin-β1，L-PK的表達，免疫熒光檢測細胞表面標志Integrin-β1的表達情況，了解血漿置換后機體內(nèi)環(huán)境的改善對外周血CD34+細胞生物學活性的影響;將熒光染料CFSE標記的慢加急性

4、（亞急性）肝衰竭患者外周血單個核細胞經(jīng)尾靜脈移植入肝損傷小鼠體內(nèi)，通過觀察CFSE標記的外周血單個核細胞在小鼠體內(nèi)的遷移、在受損肝組織的定植，比較肝損傷干細胞治療組、肝損傷組及對照組小鼠不同時間點的肝組織病理改變，了解慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血單個核細胞歸巢及修復受損肝臟的能力。
　　結(jié)果:慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34+細胞體外培養(yǎng)顯示，其具有良好的生物性活性，細胞形態(tài)、增殖、凋亡等特性較健康人外周血CD34

5、+細胞無明顯差異;慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34+細胞可分泌HGF、MMP-9、TNF-α、IL-6等可促進肝細胞生長的細胞因子，細胞表面表達PK-M2和Integrin-β1，提示慢加急性（亞急性）肝衰竭時，外周血CD34+細胞可能通過分泌細胞因子、以及向肝細胞轉(zhuǎn)化，促進肝損傷修復，改善肝功能。含血漿置換后血清培養(yǎng)組外周血CD34+細胞的增殖明顯優(yōu)于含血漿置換前血清培養(yǎng)組(p＜0.05)，提示血漿置換有利于肝衰竭患者外周血

6、CD34+細胞的增殖;含血漿置換前血清培養(yǎng)組與含血漿置換后血清培養(yǎng)組均能檢測到PK-M2、Integrin-β1，未檢測到L-PK，提示血漿置換對于外周血造血干細胞向肝細胞分化的能力并無明顯影響。肝損傷小鼠尾靜脈注射熒光染料CFSE標記的慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血單個核細胞，熒光顯微鏡下觀察肝組織冰凍切片，可見熒光標記的單個核細胞能夠遷移至受損肝組織，并定植于肝實質(zhì)內(nèi);觀察比較肝損傷干細胞治療組、肝損傷組及正常對照組小鼠不同時間

7、點的肝組織病理，可見肝損傷干細胞治療組小鼠干細胞移植后1周，肝損傷明顯改善，隨著時間的延長，肝組織損傷逐漸修復，至第3周時已基本恢復正常。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果表明，慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34+細胞具有良好的生物學活性，慢加急性（亞急性）肝衰竭患者外周血CD34+細胞還可通過旁分泌作用以及向肝細胞轉(zhuǎn)化的途徑，促進肝損傷修復，改善肝功能;血漿置換對肝衰竭患者機體內(nèi)環(huán)境的改善有利于維持外周血CD34+細胞的生物學活性，