基于miR-199調控靶向肝癌細胞的溶瘤腺病毒系統研究.pdf

1、肝癌嚴重威脅著我國人民生命健康?；?病毒治療是繼手術、放療、化療之后，肝癌靶向治療的一種非常有前景的生物治療方案。其中，溶瘤腺病毒本身具有裂解腫瘤的能力，又能介導外源基因高效表達，已成為基因-病毒治療領域重要載體。目前己建立多種腺病毒調控策略，使其特異殺傷腫瘤細胞，而對正常組織細胞基本無毒性。然而，野生型腺病毒對肝臟具有較強的嗜性，如何減少甚至避免腺病毒對正常肝細胞的毒性，仍是應用腺病毒作為載體開展肝癌基因-病毒治療所面臨的巨大挑戰(zhàn)。

2、
　　 microRNA(miRNA)是生物體內源，長度約為19-25個核苷酸的非編碼小RNA，它能通過與靶基因mRNA上的靶序列互補配對結合，在轉錄后水平對基因表達起負調控作用，導致mRNA的降解或翻譯抑制。研究表明，miRNA具有高度的時空表達特異性，一些特定的miRNA常在一類腫瘤細胞(如肝癌)中異常下調，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切。因而，可以根據microRNA的調控方式與表達特點，將miRNA引入溶瘤腺病毒的靶向性調控中，

3、即利用肝癌細胞特異性下調的miRNA調控腺病毒增殖必需基因E1A的表達，使其在相應miRNA高水平表達的正常肝細胞內不增殖(E1A被抑制)，而在相應miRNA表達缺失的肝癌細胞內有效增殖(E1A正常表達)，從而特異殺傷肝癌細胞，避免對正常肝細胞的毒副作用。
　　 miR-199a/b-3p是正常肝細胞內一種表達量非常高的miRNA(絕對表達量居第三)，且在多種類型組織中高水平表達。研究發(fā)現，miR-199a/b-3p在肝癌細胞內

4、廣譜低水平表達。在本研究中，我們將miR-199a/b-3p靶序列插入E1A的3’非翻譯區(qū)中，同時將5型腺病毒纖毛替換為5/35型嵌合纖毛，以提高病毒對腫瘤細胞的感染效率，建立基于miR-199調控靶向肝癌細胞的溶瘤腺病毒載體系統。通過Westernblotting、RT-PCR等技術研究在該調控方式作用下，腺病毒E1A的表達情況；通過病毒增殖實驗、綠色熒光報告系統等手段檢測病毒的增殖特性；應用MTT法檢測病毒對肝癌細胞的體外殺傷作用及

5、對正常肝細胞的毒副作用；建立肝癌細胞裸鼠移植瘤模型，研究病毒對移植瘤的抑制作用。
　　 結果表明，包含8個拷貝miR-199a/b-3p靶序列的溶瘤腺病毒SG7035199T能在miR-199a/b-3p低表達的肝癌細胞株(Hep3B與Huh7)中有效增殖并發(fā)揮殺傷作用，病毒感染后EIA能正常表達；而在miR-199a/b-3p高表達的正常肝細胞株(L02)及卵巢癌細胞株(SK-OV3)中基本不增殖，基本不發(fā)揮殺傷作用，病毒感染

6、后E1A被有效抑制。而對照病毒，如包含5/35型嵌合纖毛，不具有任何調控的增殖型腺病毒WAd5/35以及包含8個拷貝“種子”序列突變后的miR-199a/b-3p靶序列的溶瘤腺病毒SG7035199MT則能在Hep3B、Huh7、L02、SK-OV3中均能有效增殖并發(fā)揮殺傷作用。體內方面，SG7035199T能有效抑制Hep3B移植瘤的生長，其抑瘤能力與WAd5/35、SG7035199MT相當；對于SK-OV3移植瘤，SG703519