攜帶TRAIL和Smac的雙基因溶瘤腺病毒完全消除Bel——7404肝癌移植瘤的研究.pdf

1、Ⅰ.背景與目的:腫瘤的靶向基因-病毒治療策略是將抑癌基因整合到溶瘤病毒載體上,結(jié)合了基因治療和病毒治療的優(yōu)勢。腫瘤的發(fā)生往往是由于細(xì)胞的多個(gè)基因發(fā)生突變,因此針對(duì)腫瘤的治療應(yīng)是多基因的多靶點(diǎn)的治療。ZD55-TRAIL和ZD55-Smac聯(lián)合治療對(duì)肝癌有顯著的治療效果,這是腫瘤的靶向雙基因-病毒治療策略,許多雙基因-病毒治療手段已經(jīng)能夠完全消除裸鼠的不同類型移植瘤。但是關(guān)鍵的問題在于缺少一種理想的雙基因連接工具,把兩個(gè)抑癌基因整合到同一

2、溶瘤病毒載體上。我們首次運(yùn)用caspase-8識(shí)別位點(diǎn)序列(IETD)連接TRAIL和Smac基因,并利用溶瘤腺病毒載體ZD55,構(gòu)建了靶向雙基因溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其抑制腫瘤增殖的能力,我們希望其能更高效更徹底的抑制腫瘤增殖,為腫瘤的治療提供更為有效的靶向雙基因-病毒治療方案;同時(shí)研究新型的雙基因連接子IETD,希望為腫瘤的雙基因治療策略提供理想的連接工具。
　　 方法:①利用ca

3、spase-8抑制劑Z-IETD-FMK或激活劑5-FU與ZD55-IRAIL-IETD-Smac,同時(shí)體外處理腫瘤細(xì)胞,western blot實(shí)驗(yàn)檢測TRAIL和Smac蛋白的表達(dá),MTT實(shí)驗(yàn)分析腫瘤細(xì)胞生存率的變化。
　　 ②構(gòu)建溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD,與ZD55-TRAIL作比較,MTT實(shí)驗(yàn)分析兩者抑制腫瘤增殖效果的差別。
　　 ③MTT法與結(jié)晶紫染色檢測ZD55-TRAIL-IETD-Smac

4、體外抑制腫瘤增殖的能力及對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。
　　 ④利用Annexin V/PI雙染色法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 ⑤建立裸鼠Bel-7404肝癌移植瘤模型,研究ZD55-TRAIL-IETD-Smac體內(nèi)抗癌效果。
　　 ⑥腫瘤組織切片的H&E染色分析,TRAIL和Smac的免疫組化分析及TUNEL染色分析。
　　 結(jié)果與結(jié)論:①雙基因連接工具IETD的剪切效率被caspase-8抑制劑降低,被cas

5、pase-8激活劑升高。
　　 ②殘留在C端的IETD四肽對(duì)TRAIL蛋白的功能幾乎無影響,這為IETD介導(dǎo)TRAIL和其他抑癌基因進(jìn)行腫瘤的雙基因治療提供的理論基礎(chǔ)。
　　 ③雙基因溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac在體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用。
　　 ④雙基因溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac對(duì)人正常細(xì)胞無明顯毒性,其安全性良好。
　　 ⑤雙

6、基因溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac完全消除了裸鼠Bel-7404肝癌移植瘤,顯示了明顯的抑制腫瘤生長和延長荷瘤小鼠生存期的作用。
　　 ⑥ZD55-TRAIL-IETD-Smac具有腫瘤特異性復(fù)制能力,能夠在腫瘤的基因-病毒治療中安全高效的使用,具有極大的臨床應(yīng)用前景。
　　 Ⅱ.近年來,小分子抑制劑成為抗癌研究的熱點(diǎn)。Embelin是一種XIAP(X-linkedinhibitor of apopt

7、osis protein)的小分子抑制劑,它可以抑制XIAP的生成和活性,從而解除XIAP的抗凋亡作用,使凋亡順利進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)研究Embelin抑制肝癌細(xì)胞Bel-7404增殖的機(jī)制.采用不同濃度梯度,通過熒光顯微鏡、Hochest33342染色、MTT檢測、AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)和Western印跡分別檢測Embelin對(duì)Bel-7404細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、凋亡小體形成、細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡水平、凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響