風(fēng)疹病毒包膜糖蛋白E1的真核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、風(fēng)疹病毒(rubella vires，RV)是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，人類(lèi)是RV的唯一自然宿主。人群對(duì)RV普遍易感，感染后可發(fā)生風(fēng)疹。RV除了感染人外，實(shí)驗(yàn)室還能感染恒河猴、絨猴、猩猩、狒狒、乳鼠、地鼠和兔等野生和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并出現(xiàn)與人相似的感染過(guò)程，包括潛伏期、病毒血癥及免疫應(yīng)答反應(yīng)等，但不出疹，僅狒狒感染：RV后出現(xiàn)皮疹。 風(fēng)疹(rubella)，也叫德國(guó)麻疹，通常是一種非常溫和的疾病，一般不引起嚴(yán)重后果，通常只引起皮

2、疹、頜下淋巴結(jié)腫大和其他輕微的體征。但在年長(zhǎng)的兒童和成年人，尤其是婦女，風(fēng)疹的后果可能要嚴(yán)重的多，包括關(guān)節(jié)疾病和紫癜。RV感染的危害主要在于先天性感染，即胎兒宮內(nèi)感染。孕期前12周感染可導(dǎo)致胎兒先天風(fēng)疹感染和80～90％的患風(fēng)疹的孕婦流產(chǎn)。胎兒的先天性感染會(huì)導(dǎo)致先 天性風(fēng)疹綜合征，累及多器官、多系統(tǒng)，并存在長(zhǎng)期的活性感染。 臨床上，病毒存在于病人的鼻咽分泌物、血液、糞便和尿液中。雖然風(fēng)疹經(jīng)常為隱性感染，但亞臨床表現(xiàn)的病人也

3、有傳染性，這對(duì)風(fēng)疹的預(yù)防帶來(lái)了一定的難度。病毒通過(guò)氣溶膠擴(kuò)散，在出現(xiàn)皮疹前的7天和出現(xiàn)皮疹后的7天從鼻咽排出，具有傳染性。 先天性風(fēng)疹綜合征包括結(jié)構(gòu)畸形(主要表現(xiàn)為神經(jīng)性耳聾，白內(nèi)障，心臟疾病如肺動(dòng)脈和心臟瓣膜狹窄、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉)和智力發(fā)育障礙，晚期并發(fā)癥包括糖尿病、甲狀腺疾病、生長(zhǎng)激素缺乏和進(jìn)行性腦炎。 1962年，風(fēng)疹的病原體RV分離成功，為RV的分子生物學(xué)研究、血清學(xué)檢測(cè)、RV感染特別是先天性感染的診斷及疫苗研制等

4、奠定了基礎(chǔ)。 RV基因組為單股正鏈40S RNA，全長(zhǎng)9 762個(gè)核苷酸，其5<'、〉端和3〈'、〉端含有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架，分別編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。RV亞基因組：RNA，編碼一個(gè)分子量為110 kDa的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的前體p110，p110經(jīng)切割后產(chǎn)生核衣殼蛋白C、包膜糖蛋白E1和E2，其編碼順序?yàn)镹H<,2>-C-E2-E1-COOH。 C蛋白富含脯氨酸和精氨酸，與病毒RNA結(jié)合構(gòu)成核衣殼，在病毒從一個(gè)宿主細(xì)胞

5、感染另一個(gè)宿主細(xì)胞的過(guò)程中對(duì)病毒基因組起保護(hù)作用。包膜糖蛋白E1和E2以異二聚體的形式存在于病毒包膜表面，形成刺突，含有能刺激宿主產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答的抗原表位。 E1糖蛋白具有血凝素活性，還能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是RV的主要抗原。應(yīng)用單克隆抗體(Mab)研究發(fā)現(xiàn)，E1至少有6種不重復(fù)的抗原位點(diǎn)，主要位于E1的246～285位氨基酸。雖然E1的整個(gè)氨基酸序列在不同的毒株之間存在一定差異，但是在抗原決定簇集中的區(qū)域，其氨基酸順序卻

6、是一致的。因此E1是RV免疫原性、分子流行病學(xué)、遺傳與變異和疫苗研制研究的重要目的蛋白。 E1糖蛋白共有481個(gè)氨基酸，有三個(gè)N-聯(lián)糖化位點(diǎn)，分別位于天冬酰胺(N)76、177、和209，在E1中這三個(gè)糖基化位點(diǎn)都被糖基化，每個(gè)位點(diǎn)連接的糖鏈約為2 kD，糖基化對(duì)于保持E1的生物學(xué)活性非常重要，而且會(huì)影響E1轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，對(duì)維持E1的正確折疊和構(gòu)型有重要作用。 E2蛋白由282個(gè)氨基酸組成，分子量為42～47 kD，有

7、3～4個(gè)N．聯(lián)糖基化位點(diǎn)。E2 C-端保留了El蛋白的信號(hào)肽，富含半胱氨酸?殘基(14個(gè))，通過(guò)鏈內(nèi)和鏈間的二硫鍵與E1蛋白形成穩(wěn)定的E1-E2異二聚體，利用E2蛋白上的靶信號(hào)將異二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，進(jìn)一步組裝成病毒顆粒。E2蛋白的生物學(xué)作用尚未確定，E2可能含有特異性的表位并且至少含有一個(gè)中和表位，也能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但抗原性弱。在E1-E2復(fù)合物中，E2表位可能被E1遮蓋，而不易接近宿主免疫系統(tǒng)，因而在RV感染中誘導(dǎo)低水平的

8、免疫反應(yīng)。另外，E2在自身免疫性疾病中有一定作用，其生物學(xué)重要性同樣不能忽視。 因?yàn)楹芏嗖《靖腥井a(chǎn)生的癥狀與風(fēng)疹的癥狀很相似，所以臨床診斷風(fēng)疹不可靠?？煽康脑\斷依賴于特定的實(shí)驗(yàn)室檢查。RV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病毒分離、病毒顆粒的電子顯微鏡觀察、血清學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)、病毒基因的診斷等。 病毒分離是一種經(jīng)典的、非常可靠的診斷方法，但培養(yǎng)周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜，生物影響因素多，因此一般不用作常規(guī)診斷方法。 目前RV感染

9、的診斷主要以血清學(xué)診斷為主，目前常用的實(shí)驗(yàn)包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)、放射免疫技術(shù)(RIA)、乳膠凝集試驗(yàn)(LA)、被動(dòng)血凝試驗(yàn)(PHA)和免疫熒光試驗(yàn)(IFA)等幾種方法。其中ELISA為目前的首選方法。我國(guó)生產(chǎn)的用于檢測(cè)RV抗體的ELISA試劑盒為細(xì)胞培養(yǎng)抗原，其不足之處在于抗原純化時(shí)難以完全排除其中的細(xì)胞蛋白成分，抗原成分不均一，性質(zhì)不夠穩(wěn)定，靈敏度及特異度較差。而國(guó)外進(jìn)口的試劑盒雖然質(zhì)量較高，但價(jià)格

10、普遍昂貴，不適合基層實(shí)驗(yàn)室的使用。因此，構(gòu)建RV抗原的重組表達(dá)克隆，研究制備我國(guó)自己的重組RV抗原具有重要實(shí)際意義。 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)出現(xiàn)以后，逐步發(fā)展了直接檢測(cè)RV核酸的診斷方法。用PCR檢測(cè)RV RNA，方便、快捷、靈敏度高、結(jié)果可靠，是很有前途的實(shí)驗(yàn)診斷方法。但該檢測(cè)方法要求一定的設(shè)備和技術(shù)條件，不易在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用，而且容易造成實(shí)驗(yàn)室污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性。 自病毒分離成功后，各國(guó)致力于風(fēng)疹疫苗的研究。1

11、966年Meyer首先研制成功HPV77株風(fēng)疹減毒活疫苗，1969年獲準(zhǔn)在美國(guó)使用。其它一些毒株的風(fēng)疹減毒活疫苗也相繼問(wèn)世。目前國(guó)外使用的風(fēng)疹減毒活疫苗主要有以下幾種：HPV77-DE5或HPV77-DK12疫苗，Candehill疫苗，RA27/3疫苗，TO-336疫苗。HPV77-DE疫苗免疫效果肯定，但副反應(yīng)發(fā)生率高；Candehill疫苗免疫效果好，副反應(yīng)也相對(duì)較低，但由于成本高，、目前世界上很少使用；TO-336疫苗也有較高的

12、免疫原性，安全性較好，其產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答類(lèi)似于自然感染，并可能形成鞏固的免疫；RA27/3疫苗接種后可產(chǎn)生沉淀抗體和口咽部局部分泌性IgA(SIgA)，同時(shí)接種后的反應(yīng)也較HPV77疫苗輕，因此是目前應(yīng)用范圍最廣的風(fēng)疹減毒活疫苗。該活疫苗于1979年在美國(guó)通過(guò)審批并投入使用，該疫苗抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率在95％以上，接種后可能有短期發(fā)熱、皮疹、淋巴結(jié)腫大及關(guān)節(jié)腫痛等反應(yīng)，免疫后抗體持久性一般可維持10年左右。 因?yàn)闇p毒活疫苗的RNA有感染

13、性，有回復(fù)突變的可能，而且疫苗可通過(guò)胎盤(pán)，導(dǎo)致胎兒感染，有潛在的致畸可能性。所以，其安全性仍存在著較大爭(zhēng)議。而且成年婦女接種后可發(fā)生一過(guò)性關(guān)節(jié)炎(10％)和關(guān)節(jié)痛(2.5％)，尤其是產(chǎn)后接種。因此有必要開(kāi)發(fā)新型疫苗。RV基因工程疫苗則能消除減毒活疫苗的上述缺點(diǎn)，是當(dāng)今RV研究的熱點(diǎn)之一。 本研究采用現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，如基因重組、基因克隆、序列分析、基因的真核表達(dá)、SDS-PAGE、Westem—blot、ELISA等，

14、構(gòu)建了RV包膜糖蛋白El的全長(zhǎng)基因的酵母表達(dá)載體，并在畢赤酵母中表達(dá)出E1糖蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western—blot分析后，將重組蛋白包被ELISA檢測(cè)板，用于檢測(cè)90份人類(lèi)血清，并與進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)試劑盒做了比較分析。將所得的重組抗原免疫BABL/c鼠，觀察其免疫原性。 一、風(fēng)疹病毒包膜糖蛋白El酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 以質(zhì)粒pMDl8T-El為模板，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增RV糖蛋白El的全長(zhǎng)基因，并在基因兩端創(chuàng)建相應(yīng)

15、的酶切位點(diǎn)。El基因與pBluscript ⅡSK<'+>載體均經(jīng)雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)氨芐青霉素和藍(lán)白斑篩選并測(cè)序，建立了克隆載體pBluscript Ⅱ SK<'+>-El，克隆載體與表達(dá)載體pGAPAaA雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)Zeocin篩選并測(cè)序。 結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)一條約1.5kb的條帶，體外重組技術(shù)重組于重組質(zhì)粒pBluscriptⅡ SK<'+>和pGAPAaA后，經(jīng)P

16、CR、EcoR Ⅰ及Xba Ⅰ雙酶切均出現(xiàn)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段，測(cè)序證實(shí)為包膜糖蛋白El的基因。本研究首先成功地構(gòu)建了含有RV包膜糖蛋白El全基因的克隆載體及酵母表達(dá)載體，為El糖蛋白的表達(dá)和生物學(xué)特性的研究奠定了基礎(chǔ)。 二、風(fēng)疹病毒JR23株糖蛋白El在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和抗原性分析 El基因的表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-E1經(jīng)AvrⅡ線性化后用LiCl法轉(zhuǎn)化酵母菌，在YPD(含100 μg/ml Zeocin)平板

17、上兩次篩選，挑出單菌落，于液體YPD中培養(yǎng)，并在不同時(shí)點(diǎn)收集培養(yǎng)物，用SDS-PAGE和Westem-blot進(jìn)行分析。SDS-PAGE分析顯示El重組蛋白在畢赤酵母中高效穩(wěn)定表達(dá)，在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，之后趨于穩(wěn)定，上清和細(xì)胞中均有蛋白表達(dá)。Western-blot分析結(jié)果表明上清中的El重組蛋白能夠分別與抗RV的陽(yáng)性血清和單克隆抗體(MAb)反應(yīng)，而細(xì)胞中的El重組蛋白只能與抗RV的陽(yáng)性血清反應(yīng)，不能與MAb反應(yīng)。這說(shuō)明所表達(dá)

18、的蛋白一部分在信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌出細(xì)胞外，并經(jīng)過(guò)折疊形成了正確的構(gòu)象，能夠與MAb結(jié)合；而另一部分由于蛋白本身的跨膜區(qū)連在了細(xì)胞膜上沒(méi)有分泌出去，沒(méi)有形成能夠被MAb識(shí)別的構(gòu)象，不能與MAb結(jié)合。提示E1包膜糖蛋白在酵母菌中成功表達(dá)，且免疫反應(yīng)性良好。 三、酵母系統(tǒng)表達(dá)的風(fēng)疹病毒E1糖蛋白在ELISA診斷中的應(yīng)用研究 將重組E1抗原和RV分別作為包被抗原，用間接ELISA法檢測(cè)90份臨床血清標(biāo)本，同時(shí)用晶美(JINGMEI

19、)進(jìn)口分裝試劑盒和德國(guó)RECI公司試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；將RECI試劑盒作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算另外三者檢測(cè)結(jié)果的特異度、靈敏度和符合率；比較它們之間的差別有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，特別是重組抗原與病毒抗原作為包被抗原檢出RV抗體陽(yáng)性率的差別有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與德國(guó)試劑盒相比，該重組抗原靈敏度為67.11％，特異度為71.43％，兩者的符合率為67.78％；病毒抗原分別為50％、78.57％、54.44％；晶美試劑盒分別為84.71％、71.43％、8

20、2.22％。重組蛋白重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P>0.05，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RECI試劑盒與重組抗原、病毒抗原的檢測(cè)結(jié)果的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RECI試劑盒與晶美試劑盒的檢測(cè)結(jié)果的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；晶美試劑盒與重組抗原的檢測(cè)結(jié)果的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重組抗原與病毒抗原的檢測(cè)結(jié)果的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，作為包被抗原，重組抗原優(yōu)于病毒抗原。結(jié)果表明用畢赤酵母表達(dá)的RV E1重組蛋白作

21、為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)優(yōu)于病毒作為包被抗原，具有廣闊的應(yīng)用前景。 四、重組E1蛋白的免疫原性研究 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)遵循臨床實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的三大原則：隨機(jī)化、重復(fù)、對(duì)照。將BABL/c小鼠隨機(jī)分組，每組8只。同時(shí)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組(重組抗原加佐劑免疫)、空白對(duì)照組(PBS加佐劑免疫)、陽(yáng)性對(duì)照組1(減毒活疫苗免疫)、陽(yáng)性對(duì)照組2(RV JR23株免疫)和陰性對(duì)照組(pGAPZaA空質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物加佐劑免疫)。分別用重組抗原、P

22、BS、減毒活疫苗、RV JR23株和pGAPZaA空質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物腹腔注射免疫動(dòng)物。初次免疫時(shí)，分別用溶于100 μl PBS的45μg重組抗原、100 μl PBS、200μl減毒活疫苗、200μl 10<'5>TCID<,50>的RV JR23、溶于100μl PBS的pGAPZαA空質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同組。初次免疫后的第2、4、6周，均用初次免疫減半的抗原量再次免疫。 末次免疫后，鼠眶靜脈取血，凝固后取血清，E

23、LISA法檢測(cè)血清中的抗風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體。用卡方檢驗(yàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，X<'2>=21.7885，P<0.05，可見(jiàn)各組之間檢測(cè)結(jié)果的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別比較實(shí)驗(yàn)組與其他4個(gè)組之間的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性率高于空白對(duì)照組的陽(yáng)性率。實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組1的檢測(cè)結(jié)果的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組2的檢測(cè)結(jié)果的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

24、，可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性率高于陰性對(duì)照組的陽(yáng)性率。此檢驗(yàn)結(jié)果表明，在本研究中，重組抗原作為免疫原免疫BABL/c小鼠與減毒活疫苗作為免疫原免疫BABL/c小鼠、RV JR23株作為免疫原免疫BABL/c小鼠的免疫效果的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與PBS和空載體的表達(dá)產(chǎn)物的免疫效果的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明重組抗原能使小鼠產(chǎn)生風(fēng)疹的特異性抗體，是一種較好的免疫原。 將眶靜脈取血后的小鼠拉頸處死，無(wú)菌取脾，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，進(jìn)行脾的淋巴細(xì)胞增殖

25、實(shí)驗(yàn)(MTT法)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，F(xiàn)=7.30，P<0.05，表明5組之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后選擇陰性對(duì)照組的結(jié)果為對(duì)照，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較的新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組間的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性高于陰性對(duì)照組的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性，陽(yáng)性對(duì)照組1和陽(yáng)性對(duì)照組2的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性與陰性對(duì)照組間的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。