馬傳染性貧血病病毒的基因變異與生物學(xué)特性研究.pdf

1、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)，慢病毒屬成員，主要引起馬屬動(dòng)物慢性、終生感染，以周期性發(fā)熱、病毒血癥、貧血和血小板減少為特征。70年代，EIAV 弱毒疫苗通過以下策略成功研制：首先，將馬強(qiáng)毒EIAV-L 經(jīng)過驢體體內(nèi)傳代 113 次，獲得了高毒力的驢強(qiáng)毒EIAV-DA；然后，將EIAV-DA經(jīng)驢白細(xì)胞體外傳125代，獲得弱毒疫苗EIAV-DLA，該疫苗可保護(hù)馬和驢免受同源和異源的野生型高毒力EIAV的攻擊。中國EIAV的弱化過程可以為研

2、究其他慢病毒疫苗提供有益借鑒，然而EIAV-L，和EIAV-DLA的分子生物學(xué)特性還有待澄清?；谶@個(gè)原因，本研究中將7匹試驗(yàn)馬分別接種EIAV-DLA、vOK8266、vOK8266chltr或者空白對(duì)照，之后用EIAV-L 對(duì)所有試驗(yàn)馬進(jìn)行攻擊。vOK8266是EIAV-DLA的感染性分子克隆(命名為pOK8266)的衍生病毒。將pOK8266的5’和3’LTR替換成EIAV-L的5’和3’LTR得到嵌合感染性分子克隆(命名為pOK

3、8266chltr)，vOK8266chltr則是pOK8266chltr的衍生病毒。攻毒前后，對(duì)每種病毒的體內(nèi)復(fù)制動(dòng)力學(xué)以及抗gp45、p15、p26、p11和p9抗體進(jìn)行定期監(jiān)測。此外，對(duì)于EIAV兩個(gè)重要的基因長末端重復(fù)序列(LTR)和表面糖蛋白(gp90)的基因型與表型的關(guān)系進(jìn)行探討。具體研究內(nèi)容如下： 1、免疫期和攻毒期觀察試驗(yàn)馬EIA疾病進(jìn)展7匹血清抗EIAV抗體陰性馬分別命名為1＃、2＃、4＃、5＃，6＃、7＃和8

4、＃。4＃和5＃接種克隆毒 vOK8266，6＃和7＃接種嵌合毒 vOK8266chltr，8＃接種疫苗毒EIAV-DLA，1＃和2＃為接種對(duì)照。6個(gè)月后，對(duì)5匹接種馬和2匹接種對(duì)照馬以野生型強(qiáng)毒 EIAV-L 攻擊。攻毒前后，每天觀察各試驗(yàn)馬直腸溫度和臨床癥狀。免疫期的6個(gè)月中，各試驗(yàn)馬沒有出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象，表明各接種毒株對(duì)試驗(yàn)馬是安全的，即使vOK8266chltr的LTR是來源于強(qiáng)毒EIAV-L的。攻毒后，1＃、2＃和 7＃出現(xiàn)典型的馬

5、傳貧癥狀，經(jīng)過數(shù)個(gè)發(fā)熱期后死亡，其余各試驗(yàn)馬在攻毒后13個(gè)月的觀察期內(nèi)沒有出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀。 2、馬體內(nèi)EIAV的復(fù)制動(dòng)力學(xué)為了研究每種病毒在試驗(yàn)馬體內(nèi)的復(fù)制情況，攻毒前后對(duì)各試驗(yàn)馬血漿中病毒RNA載量和外周血單核細(xì)胞(PBMC)前病毒DNA載量進(jìn)行了定期檢測。進(jìn)行檢測之前，首先建立了用于檢測EIAV基因組的realtime PCR和realtime RF-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。攻毒前的大多數(shù)時(shí)期，vOK8266chltr接種的試驗(yàn)

6、馬血漿RNA載量為每毫升血漿10<'4>到10<'5>拷貝，比vOK8266和EIAV-DLA接種的試驗(yàn)馬在同時(shí)期的血漿RNA載量要高，后兩者的RNA載量一般低于10<'4>拷貝。結(jié)果表明 EIAV-L的LTR比EIAV-DLA在體內(nèi)有更高的啟動(dòng)子活性。然而，并沒有發(fā)現(xiàn)PBMC前病毒DNA載量有類似的差異。攻毒后，與未發(fā)病馬相比，發(fā)病馬血漿在發(fā)熱期含有高得多的病毒RNA載量(高于每毫升10<'6>拷貝)，而在發(fā)熱間歇期，病毒RNA載量也

7、高于每毫升血漿10<'5>拷貝。結(jié)果表明高水平的病毒復(fù)制可促進(jìn)疾病進(jìn)展。攻毒3個(gè)月后，多數(shù)未發(fā)病馬檢測不到血漿病毒 RNA，表明在這些未發(fā)病馬體內(nèi)病毒復(fù)制受到抑制。然而，攻毒前后的任何采樣時(shí)期，在發(fā)病馬和未發(fā)病馬體內(nèi)都能檢測到前病毒DNA。體內(nèi)前病毒DNA的持續(xù)存在對(duì)EIAV持續(xù)感染的作用有待于進(jìn)一步研究。 3、抗體反應(yīng)為了評(píng)價(jià)感染動(dòng)物對(duì)疫苗毒和強(qiáng)毒的免疫反應(yīng)，攻毒前后，利用 ELISA 方法定期檢測所有試驗(yàn)馬針對(duì)病毒 gp45

8、、p15、p26、p11和 p9的特異性抗體。免疫后，4＃和5＃體內(nèi)的抗 gp45、p15和p26的抗體早于或高于其它試驗(yàn)馬，可能是由于vOK8266chltr在馬體內(nèi)的復(fù)制水平高于vok8266和EIAV-DLA。攻毒后，發(fā)病的1＃和7＃體內(nèi)抗g045，p15和p26的抗體很快達(dá)到峰值并一直維持在高水平，而2＃在大多數(shù)抗體產(chǎn)生前死亡。與之不同的是，除6＃外，其余未發(fā)病馬體內(nèi)抗gp45，p15，p26，p11和p9的抗體水平在攻毒后一直

9、不高。攻毒前后，未發(fā)病的6＃與發(fā)病的7＃有著相似的抗體水平，這可能是由于它們都接種 vOK8266并都用EIAV-L 攻擊所致。以上結(jié)果表明，高的抗體水平與試驗(yàn)馬的保護(hù)之間沒有必然聯(lián)系。p11和p9抗體只有在攻毒后的發(fā)病馬體內(nèi)能被檢測到，提示這兩種抗體的產(chǎn)生可能預(yù)示著EIA的疾病進(jìn)展。 4、體內(nèi)和體外前病毒 gp90的變異趨勢病毒gp90和LTR是EIAV基因組變異最大的區(qū)域，兩者對(duì)病毒致病性都起著重要作用。了解這兩個(gè)基因的變異

10、趨勢對(duì)研究 EIAV 控制策略是至關(guān)重要的。攻毒前后從定期采集自1＃，4＃(或5＃)，7＃和8＃的白細(xì)胞樣品中提取總DNA，巢式PCR擴(kuò)增包含前病毒gp90基因高變區(qū)2(V2)到高變區(qū)5(V5)的片段。對(duì)免疫期獲得的序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明EIAV-DLA的gp90是一個(gè)準(zhǔn)種，而在EIAV-DLA接種馬體后它會(huì)變?yōu)橐粋€(gè)更為復(fù)雜的準(zhǔn)種。在8＃體內(nèi)，EIAV-DLA序列有向EIAV-L突變的趨勢，提示可能存在EIAV-DLA毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)

11、。免疫了vOK8266和vOK8266chltr的試驗(yàn)馬體內(nèi)病毒gp90也有類似的變化。所有試驗(yàn)馬用EIAV-L 攻擊后，只有EIAV-L的序列被克隆到。發(fā)病馬體內(nèi)病毒gp90發(fā)生了高度的序列變異，且變異比較集中于V3區(qū)，而未發(fā)病馬體內(nèi)的gp90只有中等程度的變異。新的發(fā)熱期伴隨著新gp90準(zhǔn)種的出現(xiàn)，新準(zhǔn)種帶有大量的PND變異，提示PND的突變可能對(duì)病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視起重要作用，免疫逃避可以造成EIAV持續(xù)性感染和促進(jìn)疾病進(jìn)展

12、。病毒gp90序列的ds/dn值表明機(jī)體對(duì)病毒的免疫選擇壓力在發(fā)病馬的慢性感染期是強(qiáng)陽性的，但是未發(fā)病馬的免疫選擇壓力一直較弱。此外，只有在未發(fā)病馬體內(nèi)獲得了大量gp90缺陷突變體，這可能是使病毒復(fù)制水平降低而使感染馬存活的原因之一。突變產(chǎn)生的終止密碼子多數(shù)位于V4區(qū)的缺陷“熱點(diǎn)”。 5、體內(nèi)和體外前病毒LTR的變異趨勢分別從感染 EIAV-DA 或 EIAV-DLA的體外培養(yǎng)驢MDM、感染EIAV-L的馬PBMC、定期采集的試

13、驗(yàn)馬1＃，4＃和8＃的 PBMC等樣品中半巢式PCR擴(kuò)增前病毒LTR。從EIAV-L、EIAV-DA和 EIAV-DLA 中分別獲得11、10和14個(gè)LTR序列，比較結(jié)果表明LTR-L和LTR-DA都為單一序列，而LTR-DLA則是一個(gè)由不同序列構(gòu)成的準(zhǔn)種，提示我們病毒在體外傳代弱化的過程是 LTR-DLA 復(fù)雜準(zhǔn)種形成的主要原因。在LXR-DLA的U3和R區(qū)分別定義了兩個(gè)高變區(qū)。有意思的是LTR-DLA準(zhǔn)種接種8＃后，LTR-DLA1

14、2被迅速選擇為優(yōu)勢序列并且此后高度保守。從1＃和4＃獲得的序列也表明 LTR 在病毒的體內(nèi)感染過程中是高度保守的。 6、不同EIAV毒株LTR的啟動(dòng)子活性研究為了闡明LTR-DLA的高變區(qū)A和B的突變對(duì)IXR功能的影響，分別從EIAV-L、EIAV-DA和EIAV-DLA中選擇1個(gè)或2個(gè)具有代表性的LTR序列，構(gòu)建pLTR/CAT系列質(zhì)粒。通過EIAV-L的LTR R區(qū)替換EIAV-DLA的R區(qū)獲得了2個(gè)嵌合pLTR/CAT質(zhì)粒

15、。在加或不加EIAV-L Tat表達(dá)質(zhì)粒的情況下，pLTR/CAT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染馬單核巨噬細(xì)胞。結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，所有LTR的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性都很低，并且它們之間的差異不顯著。在共轉(zhuǎn)染 Tat 表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，LTR-DLA較 EIAV-L 和EIAV-DA有更高的LTR啟動(dòng)子增強(qiáng)活性。強(qiáng)弱毒LTR的嵌合體pLTR/CAT質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，強(qiáng)弱毒LTR之間啟動(dòng)子活性差異主要是由R區(qū)的序列差異造成的,與U3區(qū)序列關(guān)系不大。特別是LTR-TA