馬傳染性貧血病毒LTR關(guān)鍵點(diǎn)突變對(duì)DLV致弱機(jī)理的研究.pdf

1、馬傳染性貧血病毒(equineinfectiousanemiavirus，EIAV)可以引起馬屬動(dòng)物的一種急性烈性傳染病，以貧血、持續(xù)感染、反復(fù)發(fā)熱為特征，終生持續(xù)感染，是馬屬動(dòng)物最重要的傳染病之一。EIAV與人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)同屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科、慢病毒屬成員，兩者在抗原特性、基因組結(jié)構(gòu)等方面極為相似，以及從經(jīng)濟(jì)與安全性角度上考慮，EIAV將是研究HIV乃至慢病毒的最理想的動(dòng)物模

2、型。 為了闡明我國(guó)馬傳染性貧血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子機(jī)制，利用我國(guó)馬傳染性貧血病毒疫苗培育系統(tǒng)(由強(qiáng)毒到弱毒的不同代次病毒)，對(duì)EIAV弱毒疫苗致弱過(guò)程中不同代次EIAV毒株非編碼區(qū)LTR序列分析，發(fā)現(xiàn)病毒致弱的基因變異規(guī)律性位點(diǎn)，即LTRR區(qū)序列呈現(xiàn)規(guī)律性變化：TAR結(jié)構(gòu)起始位置堿基在59代之前多數(shù)為A，而64代之后均為G；poly(A)附加位點(diǎn)在45代之后(除55代外)一致表現(xiàn)為AA，提示這些突變引起的位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)變化很可

3、能與病毒毒力減弱有直接關(guān)系。因此基于EIA代次毒株LTR序列分析結(jié)果，選取EIAV基因非編碼區(qū)LTRR區(qū)作為研究對(duì)象，以驢胎皮膚弱毒疫苗感染性分子克隆pLGFD3-8為父本操作系統(tǒng)進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變，即LTRR區(qū)的TAR結(jié)構(gòu)起始?jí)A基由弱毒株的G變?yōu)閺?qiáng)毒株特征A，poly(A)附加位點(diǎn)堿基由弱毒株的AA變?yōu)閺?qiáng)毒株特征CA，形成具有四處點(diǎn)突變型強(qiáng)弱嵌合感染性的分子克隆。構(gòu)建EIAV非編碼區(qū)強(qiáng)弱毒嵌合的全基因分子克隆，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pL

4、GFD-M。將該嵌合克隆體外轉(zhuǎn)染驢胎皮膚細(xì)胞(FDD)并進(jìn)行FDD傳代，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶活性試驗(yàn)、前病毒DNAPCR擴(kuò)增、RT-PCR方法及實(shí)時(shí)定量RT-PCR等試驗(yàn)驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染結(jié)果。結(jié)果顯示，LTR嵌合克隆衍生病毒感染FDD出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，電鏡下可見大量典型的EIAV顆粒，將其病毒命名為vpLGFD-M；細(xì)胞培養(yǎng)上清可檢測(cè)到RT酶活性；前病毒DNAPCR擴(kuò)增和RT-PCR均為陽(yáng)性。在細(xì)胞水平上對(duì)該嵌合克隆衍生毒及其親本感染性分子克隆毒株

5、復(fù)制能力進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)此嵌合克隆衍生病毒比其父本克隆衍生病毒的復(fù)制水平略高些，保持了親本皮膚弱毒疫苗感染分子克隆的復(fù)制特點(diǎn)和細(xì)胞嗜性。 本研究在分子生物學(xué)方面的新發(fā)現(xiàn)是——明確了EIAVLTR反轉(zhuǎn)錄時(shí)，病毒RNA是先由5'LTR的R-U5與3'LTRU3重組形成前病毒基因組一端的長(zhǎng)末端重復(fù)序列“新”3'LTR，在新形成的3'LTR上的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄基因的指導(dǎo)下，進(jìn)行EIAV的復(fù)制與蛋白質(zhì)的合成。 本項(xiàng)研究對(duì)進(jìn)一步在分子水