大鼠C6膠質瘤細胞系中腫瘤干細胞樣細胞的鑒定及其生物學特性的研究.pdf

1、背景：膠質瘤，尤其是膠質母細胞瘤，惡性程度高，術后復發(fā)快，且對放化療敏感性差，5年生存率僅為20％左右，因而一直是神經外科治療中最為棘手惡性腫瘤之一。腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)理論的認為，腫瘤細胞中僅有一小部分腫瘤細胞，稱為CSC，真正具有自我更新、無限增殖、多向分化潛能等干細胞樣特性，它們是腫瘤發(fā)生，轉移和復發(fā)的根源，而腫瘤中的絕大部分細胞不具有上述特性。研究者已經先后從人類髓母細胞瘤與不同級別的膠質瘤中分

2、離得到了腦腫瘤干細胞(brain tumor stem cells，BTSC)，因而CSC理論的提出為我們從一個全新的角度認識膠質瘤發(fā)生、發(fā)展機制，并進一步開發(fā)出靶向治療措施帶來了希望。 目的：1.明確大鼠C6膠質瘤細胞系內是否存在腫瘤干細胞樣細胞及其生物學特性。2.比較當今主流的CSC鑒定方法在鑒定分離獲得C6腫瘤干細胞樣細胞過程中的效果。3.探討將C6腫瘤干細胞樣細胞應用于人類BTSC研究中的前景。 方法：1.應用無

3、血清培養(yǎng)基(DMEM/F-12，添加bFGF，EGF和B27)培養(yǎng)獲得懸浮腫瘤克隆球；用有限稀釋法在無血清條件下對C6單細胞進行連續(xù)克隆培養(yǎng)，檢測其自我更新能力；用含血清培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS)誘導分化，以免疫熒光和免疫組織化學技術檢測C6單細胞克隆多向分化能力以及分化抗原的共表達情況：用含血清培養(yǎng)基擴增后，通過裸鼠致瘤實驗檢測C6單細胞克隆連續(xù)體內致瘤能力。2.將無血清培養(yǎng)獲得的C6腫瘤克隆球連續(xù)培養(yǎng)于交替的血清/無血清培養(yǎng)基

4、，檢測C6系中腫瘤干細胞樣細胞的比例是否穩(wěn)定：流式細胞儀與免疫組織化學檢測不同培養(yǎng)條件下CD133陽性細胞和分化細胞的比例。3.應用免疫磁珠分離CD133陽性與陰性細胞；利用Western Blot技術和免疫熒光技術檢測分離細胞的純度：利用BrdUrd染色檢測細胞的增殖能力：利用有限稀釋單細胞克隆培養(yǎng)，血清培養(yǎng)基誘導分化，以及裸鼠體內種植的方法分別檢測CD133陽性與陰性C6細胞的自我更新能力，多向分化能力，以及連續(xù)體內致瘤能力。4.將

5、用于流式細胞術獲得側群細胞的Hoechst 33342染料孵育C6細胞不同時間，檢測其對C6細胞的毒性作用，同時檢測ABCG2的表達；利用單細胞克隆培養(yǎng)的方法檢測孵育后C6細胞的自我更新與無限增殖能力。 結果：1.C6細胞系中有>60％的細胞能在無血清培養(yǎng)基中形成懸浮腫瘤克隆球；腫瘤克隆球細胞中，>80％的單細胞克隆具有自我更新能力：能在血清誘導下產生表達神經元與膠質細胞分化標記的子代腫瘤細胞，并且含血清培養(yǎng)基中的貼壁C6細胞具

6、有共表達CD133與GFAP/NSE的現象，而在無血清培養(yǎng)基中的克隆球中該現象很少見：在裸鼠皮下種植后則顯示出連續(xù)致瘤性。2.無血清中形成的C6懸浮腫瘤克隆球被轉移到血清培養(yǎng)基后，能夠再次貼壁生長，而隨后的血清/無血清交替培養(yǎng)并不影響C6系中能夠在無血清培養(yǎng)基中形成懸浮腫瘤克隆球的細胞比例：流式細胞儀與免疫組織化學顯示血清培養(yǎng)基中貼壁C6細胞的CD133陽性率為30％左右，而在無血清克隆球中該比例上升到>85％。3.CD133陽性與陰性

7、C6細胞中均含有腫瘤干細胞樣細胞，但是前者在細胞增殖能力與致瘤速度等方面顯著強于后者，而且兩者的克隆球生長方式也存在差異。4.長時間Hoechst 33342染色對于大部分C6細胞具有毒性作用，使其喪失自我更新能力等CSC特性：但是同時也發(fā)現存在1％左右的Hoechst 33342陰性、ABCG2陽性的側群細胞，其仍然保留有CSC的特征。 結論：1.大鼠C6膠質瘤細胞系中存在腫瘤干細胞樣細胞，具有與人類原發(fā)腦腫瘤中BTSC相似的

8、生物學特點。2.利用無血清懸浮克隆球培養(yǎng)方法所發(fā)現的C6細胞中腫瘤干細胞樣細胞的比例遠高于依賴CD133作為CSC表面標記的鑒定方法(>60％．30％)，而且CD133陰性亞群中同樣存在腫瘤干細胞樣細胞；Hoeehst 33342的毒性會使無法排出Hoechst 33342的非側群細胞喪失CSC的特性。3.雖然今后仍然需要努力尋找到一種更為全面而可靠的BTSC鑒定方法，但是考慮到C6系中大部分細胞符合目前對CSC的定義，因此其仍不失為一